在蛋白质分离过程中，分离液体经过一个固态物质后所发生的组分分布变化称为色层分析法，简称层析法，又称色谱法。层析法是由俄国化学家茨维特（M.C.Tswett）在1907年最先提出的，是目前应用最广泛的一种分离技术。

层析是利用不同物质理化性质的差异建立起来的技术。由于混合物中各组分的分子形态、大小、极性及分子亲和力等理化性质不同，当它们流经处于相邻的两相时，不同的物质在两相中的分布就会不同。在层析分配中，流动相起运载作用，固定相有阻滞作用，不同物质根据分配系数（分配系数表示为K）不同在两相中分配：K=（溶质在固定相中的浓度）/（溶质在流动相中的浓度）

K值越大，表示某种物质在固定相中吸附得越牢固，在固定相中停留的时间越长；在流动相中迁移的速度越慢，溶质出现在流动相中越晚。反之，K值越小，则溶质出现在洗脱液中越早。混合物中各组分K值不同是各组分得以分离的前提条件。但K值在不同类型的层析中的含义不同，在吸附层析中K值为吸收平衡系数；分配层析中K为分配系数；离子交换层析中K为交换系数；亲和层析为亲和系数。

层析分离具有分离效率高、选择性强、应用范围广、操作方便、设备简单等优点，适用于杂质多、含量少的复杂样品分析。尤其是用于生物样品分离分析。其缺点为处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此主要用于实验室。

层析法不仅适用于分离小分子物质，比如氨基酸、核苷酸、色素、生物碱和抗生素等，也适用于分离生物大分子物质，比如：蛋白质、核酸、多糖等。对于蛋白质的分离纯化来说，一般采用的是液—固层析法和柱层析法。

（一）柱层析

1．凝胶过滤层析

（1）原理

凝胶过滤层析又称凝胶过滤色谱或分子筛，是运用蛋白质分子量和分子形状的差异来进行分离。其支持物是多孔的凝胶，不同分子流经凝胶层析柱时，分子直径比较大的分子不能进入凝胶颗粒的微孔，只能经过凝胶颗粒之间的孔隙，这样的分子是随溶剂一起移动的，所以最先流出柱外；分子直径比凝胶孔径小的分子则能够进入凝胶颗粒的微孔内部（即进入凝胶相内），结果导致小分子向下移动的速度落后于大分子。所以分子量大的蛋白先被洗脱下来，而小分子蛋白最后流出来。

样品（含有大小不同的分子）溶液加在层析柱顶端；样品溶液流经层析柱，小分子通过扩散作用进入凝胶颗粒的微孔中，而大分子则被排阻于颗粒之外；向层析柱顶端加入洗脱液，大分子先流出层析柱；小分子受到滞留随后流出层析柱。

凝胶过滤层析有如下优点：根据分子质量大小进行蛋白质的纯化；可测定蛋白质的分子量；可研究蛋白质二聚体或寡聚体的存在；蛋白质纯化过程中和纯化后的脱盐，与透析法相比，凝胶过滤层析除盐速度快，不影响生物大分子的活性。

（2）仪器设备及试剂

①仪器设备：凝胶过滤层析系统由层析柱、加样系统、调节缓冲液流速的蠕动泵、紫外检测系统和记录仪组成。

②凝胶过滤层析介质：常用介质有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。高度交联的凝胶可以分离蛋白质和其他分子量更小的分子，也可以利用它去除低分子量的缓冲液成分和盐。较大孔径的凝胶用于蛋白质分子之间的分离。

（3）操作步骤

①柱平衡（PBS）。

②上样：样品全部进入凝胶柱床后，用PBS充满凝胶柱上层空间，连入层析系统。

③样品分离：用PBS洗脱、收集。紫外光吸收法进行检测。

④样品检测：SDS-PAGE判断分离样品分子质量和纯度。

（4）注意事项

分级分离时，宜选用长柱，组别分离使用短柱；对于Sephadex软胶来说，系统反压的保持十分重要，可用恒流泵控制提高Sephacryl、Sepharose CL的操作压；装柱切忌出现气泡；凝胶过滤层析的上样体积不可超过柱体体积的1％～5％，样品中的浓度一般不超4％，样品本身对洗脱液的相对黏度不超过2％；凝胶过滤层析的分辨能力受限于凝胶介质本身，但采用降低流速、选用小直径（超细凝胶）、选取狭分级范围的介质材料等办法可提高分辨能力。

2.亲和层析

配基与配体之间可以特异性吸附，因而达到分离目的的层析称为亲和层析，如抗原和抗体、酶和底物（或酶的竞争性抑制剂）以及DNA和DNA结合蛋白之间特殊的亲和力。在一定条件下，上述配基和配体可以牢固地结合形成复合物。具有亲和作用分子以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂。亲和层析的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称为配基。

亲和层析的简要过程如下：首先将支持物—配体络合物通过适当的缓冲液装到柱中，然后将蛋白质粗提物加到柱顶，当溶液通过层析柱时，可与配体结合的蛋白被固定在柱上，而大多数杂质则径直通过。杂质被除去后，再用适当的方法将吸附于柱上的蛋白洗脱下来。亲和层析纯化过程简单、迅速，分离效率高，适用于分离含量极少又不稳定的活性物质。

亲和层析的理想载体的特点：①非特异性吸附少的惰性物质；②机械性能好，具有一定的颗粒形式，流速恒定；③不溶于水且高度亲水；④理化性质稳定；⑤多孔的网状结构，通透性好，大分子能自由通过；⑥可供活化的化学基团丰富；⑦能抵抗微生物和醇的作用。

作为固相载体的物质有皂土、石英/玻璃微球、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、氧化铝、纤维素和琼脂糖等。其中，皂土、玻璃微球吸附能力较弱，不能防止非特异性吸附，纤维素的非特异性吸附能力强，聚丙烯酰胺凝胶是最常用的载体。(www.daowen.com)

琼脂糖凝胶具有亲水性强、理化性质稳定、不受细菌和酶的作用等优点。它具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，0.1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl处理2h～3h及蛋白质变性剂7mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，不会引起性质改变，易于再生和反复使用。

亲和层析的步骤

①琼脂糖活化：Sepharose4B放在布氏漏斗中抽干，少量的NaHCO3洗涤，转入100mL烧杯中，冰浴置于磁力搅拌器上；取2g溴化氰溶解（通风橱），倒入琼脂糖，滴加2mol/LNaOH调pH值至11，反应10min。转入布氏漏斗，以冰水抽洗成中性，再以NaHCO3抽洗。

②将需偶联的抗原（或抗体）蛋白与活化的琼脂糖结合。

③装柱：一般1.5×15cm的层析柱可装偶联蛋白的琼脂糖约30mL。

④洗柱：以NaHCO3洗涤至洗出液的OD280＜0.02为止。收集液测得的OD280×洗脱液的总体积即为未偶联蛋白的含量，由此可计算偶联率。

⑤吸附与解吸附：PBS洗脱至洗出液OD280＜0.02为止；甘氨酸-HCl缓冲液收集解吸附下来的成分，NaHCO3中和以免蛋白变性；先后以尿素、PBS或生理盐水洗涤，平衡后可继续使用。于20％的乙醇在4℃下保存，防止冷冻和干裂。

⑥结果判定：蛋白经双相琼脂糖电泳进行纯度鉴定；经生理盐水透析后浓缩或冻干保存。

3.离子交换层析

以离子交换剂为固定相，根据流动相中的组分离子和交换剂上的平衡离子结合力大小的不同而进行分离的层析方法称为离子交换层析（Ion Exchange Chromatography），简称IEC。

离子交换层析的原理为被分离物质所带的电荷可与离子交换剂所带的相反电荷结合，这种带电分子与固定相之间的结合作用是可逆的，改变pH值或逐渐增加缓冲液的离子强度，离子交换剂上结合的物质可以由于发生交换而被洗脱下来。通过化学反应将带电基团引入到惰性支持物上，形成离子交换剂。蛋白质分子是带电大分子，带电状态在不同液相环境中会发生变化。根据蛋白质分子带电状态的不同，在一定pH条件下，离子交换层析可分离蛋白质。根据基团所带的电荷不同离子交换剂可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。离子交换剂是由纤维素、葡聚糖凝胶、树脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等不溶于水的网状结构高分子聚合物骨架组成。

离子交换层析的过程简要如下：

（1）预处理和装柱：装柱前将离子交换纤维素少量碎的不易沉淀的颗粒洗去，以保证均匀度较好（已溶胀好的凝胶不需要此步）。洗涤好的纤维素先平衡至所需的pH值和离子强度，减压除气泡。溶胀后，用稀酸或稀碱处理交换剂，使之成为阳/阴离子交换剂型。阴离子交换剂用“碱—酸—碱”处理，最终转为OH-型/盐型交换剂；阳离子交换剂用“酸—碱—酸”处理。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，使分辨率提高。

（2）加样与洗脱：初始缓冲液的pH值和离子强度与样品相同，pH值范围应在交换剂与被结合物有相反电荷的范围。上样量不要超过柱的负荷能力，柱的负荷能力可根据交换容量计算，上样量通常为交换剂交换总量的1％～5％；吸附柱上已结合样品，改变溶液的pH值/离子强度或同时改变pH值与离子强度，可将样品洗脱。逐步改变pH或离子强度，可以完全分离更复杂的组分，最常用的方法是连续梯度洗脱：将两个容器置于同一水平面，一个容器盛有一定pH的缓冲液，另一个容器含有高盐浓度或不同pH值的缓冲液，两容器联通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一个容器流入柱时，第二个容器中的溶液就会自动补充，经搅拌与第一个容器的溶液相混合，流入柱中的缓冲液的pH值与离子强度是梯度变化的。

（3）洗脱条件：洗脱液一般是床体积的几十倍；为了使紧密吸附的物质能被洗脱下来，洗脱梯度要足够高；洗脱梯度上升不宜过快；目的物过早解吸，会引起区带扩散，而目的物过晚解吸，峰形会变宽。

（4）柱的再生：NaCl可用于离子交换纤维素的洗柱；NaOH可用于含强吸附物的洗柱；脂溶性物质可用非离子型去污剂洗柱。阴离子交换剂宜用0.002％氯已定（洗必泰）保存，阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005％）或0.02％叠氮钠保存。

（二）高效液相色谱

二十世纪六十年代末，在经典的液/气相色谱法的基础上，高效液相色谱法这一新型分离分析技术得到发展。高效液相色谱法的原理与经典色谱法的分离机制大致相同。两个组分的分配系数不同，因而流动相携带的物质的移动速度不同，色谱过程相当于物质分子在相对运动的两相间的一个分配平衡的过程，即色谱柱中形成了差速迁移而被分离是由于物质在流动相与固定相之间的分配系数不同。蛋白质是一种长链高分子化合物，相对分子量大，在溶液中的扩散系数小、黏度大、易变性，这增加了蛋白质分离、分析的困难。在高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）技术中，分配色谱、亲和色谱、离子交换色谱和凝胶排阻色谱都能够用于蛋白质的分离与鉴定。

1.高效液相色谱仪　高效液相色谱仪的组分有：储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等，也可分为五大系统：进样系统、分离系统、高压输液系统、检测系统和记录系统。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数。用甲醇、水及流动相冲洗柱子，柱子达到平衡后，进样分离，分离后的组分依次流入检测器中进行检测，所测得的信号被记录器记录下来。样品制备时，分离后的组分依次和洗脱液一起排入流出物收集器中收集。

高效液相色谱仪只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制，流动相可选择的范围宽，固定相的种类繁多，因而可以分离热不稳定和非挥发性的各种分子量的蛋白质。

2.高效液相色谱法的特点

（1）分离效能高：采用微粒径固定相填料，液相色谱填充柱100000/m可达理论塔板数，远远高于经典色谱。

（2）选择性高：由于可通过流动相的设计控制和改善分离过程，高效液相色谱法拥有了无限选择性。

（3）检测灵敏度高：高效液相色谱的高柱效，使组分的局部浓度明显增大，大大提高了检测器的灵敏度。

（4）分析速度快：高压输液泵和耐高压固定相的使用，流动相流速可以加快，完成一个样品的分离分析时间仅需几分钟到几十分钟。