蛋白质分子从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀,蛋白质溶液是亲水溶胶,变性后的蛋白质较易于沉淀。电荷和水化膜是稳定蛋白质的因素,除去水化膜和中和蛋白质的电荷可以使蛋白质沉淀。单独破坏蛋白质的水化膜(使用乙醇、硫酸钠等脱水剂)、调整蛋白质的pH值到等电点都不能使蛋白质立即沉淀。
蛋白质纯化初期,沉淀法可大幅缩减样品体积,达到浓缩样品的目的,便于后续纯化。此方法还将目的蛋白与其他物质区分开来,目的蛋白的回收率比较高。蛋白质沉淀是常用的分离纯化蛋白质的方法。沉淀法只适用于蛋白质的初步分离纯化,需要通过专门的蛋白质纯化方法进一步提高蛋白质纯度。蛋白质沉淀法具有设备简单、操作方便的优点,在实验室内得到广泛应用。蛋白质沉淀有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、聚乙二醇沉淀法和选择性沉淀法等。
(一)盐析法
盐析法是指在溶液中加入无机盐类使溶质溶解度降低而析出的过程。蛋白质的粗提阶段,常用盐析法来沉淀分离蛋白质。盐析法具有条件温和、操作简便等优点。盐析法通常分为:pH和温度不变,改变离子强度,此操作常用于早期的粗提液;一定的离子强度,改变pH和温度,此操作常用于后期进一步的分离纯化和结晶。盐析法沉淀目的蛋白,可以浓缩和初步分离纯化蛋白质。影响盐析的因素有如下几种:
1.蛋白质浓度 一般认为20%~30%的蛋白质浓度比较有利于盐析沉淀。低浓度蛋白质溶液中共沉淀作用比较弱,而所用的盐量较多;极高浓度的蛋白质溶液中会发生严重的共沉淀作用,因而需要根据具体情况选择适当的溶液浓度。对于分步分离提纯,浓度低一些的蛋白质溶液更利于操作,可以适当多加一些中性盐,使共沉淀作用减至最低。
2.pH值 蛋白质所带净电荷越多溶解度越大,所带净电荷越少溶解度越小,在等电点时蛋白质溶解度最小。将溶液pH值调整到目的蛋白的等电点处可以提高盐析效率。这样不仅提高了蛋白质的收率,而且所消耗的中性盐较少,同时还可以减弱共沉淀作用。但值得注意的是:在水中或稀盐溶液中的蛋白质的等电点与在高盐浓度中是有所不同的,需根据溶液的盐浓度调整溶液pH值,以达到最好的盐析效果。
3.温度 一般情况下,盐析法对温度无特殊要求,可在室温下操作。一些对温度比较敏感的蛋白质要求在0-4℃进行盐析。在低盐溶液或纯水中,温度增加,蛋白质溶解度也会增加;而在高盐浓度下,蛋白质的溶解度会随着温度上升而下降,但应注意,蛋白质在高温条件下容易降解和变性。所以应结合溶液的盐浓度考虑来选择合适的温度。
4.离子强度和类型 操作中是从低离子强度到高离子强度顺次进行分离。一种或几种蛋白被盐析出来后,再提高溶液中中性盐的饱和度,可析出另一组分的蛋白质。盐析得到的不同组分的蛋白质可经过过滤或冷冻离心收集得到,进行后续的研究。离子类型对蛋白质溶解度有一定的影响,离子半径小、电荷高的离子对盐析的影响较大;离子半径大而电荷低的离子对盐析影响较弱。高价阴离子的沉淀效果比较好;单价阳离子中,铵离子效果要好于钾离子和钠离子;磷酸盐的效果要好于硫酸盐和醋酸盐。
(二)有机溶剂沉淀法
有机溶剂会降低水的介电常数,增加蛋白质分子之间的静电引力,蛋白质相互聚集沉淀;由于水溶性有机溶剂亲水性强,会抢夺与蛋白质结合的自由水,破坏蛋白质表面的水化层,从而使蛋白质分子间相互作用增大而凝聚沉淀。常用乙醇、甲醇和丙酮等能和水互溶的有机溶剂。有机溶剂沉淀法具有蛋白质只能在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内析出,分辨率较高,获得的蛋白不用再经过脱盐、过滤,较为容易等优点。其缺点是蛋白质等生物大分子容易变性失活、低温操作,操作中需要注意安全。通常向溶液中加入等体积的丙酮或4倍体积的乙醇,蛋白质就可以沉淀下来,然而加入的丙酮或乙醇等有机溶剂稀释了溶液,所以溶液中的蛋白质浓度要大于1mg/mL。影响有机溶剂沉淀的因素有如下几种:
1.温度 有机溶剂与水混合会放出大量的热,使溶液温度升高,而蛋白质在高温条件下会变性。另外,有机溶剂对蛋白质的沉淀能力也与温度有关,温度越低沉淀越完全。有机溶剂沉淀蛋白质的操作过程应在低温下进行。
2.蛋白质浓度和pH 在高浓度的蛋白质溶液中会发生严重的共沉淀作用。不同pH值的溶液所需有机溶剂的量也不同。
3.离子强度 蛋白质溶液中盐浓度太大或太低都不利于蛋白质的分离。在一定范围内,盐浓度越低蛋白质沉淀越完全,蛋白质越不易变性。中性盐浓度范围为0.01~0.05mol/L,实验中常用的中性盐有乙酸钠、乙酸铵、氯化钠等。(www.daowen.com)
4.金属离子 一些多价阳离子如Zn2+和Ca2+在一定pH下能与呈阴离子状态的蛋白质形成更易于在水中或有机溶剂中沉淀的复合物,可以减少溶剂用量。这些金属离子不影响蛋白质的生物活性,操作中可以先加入有机溶剂沉淀去除杂蛋白,再加入金属离子沉淀目的蛋白。
(三)等电点沉淀法
蛋白质在溶液pH值等于等电点时,分子表面电荷为零,分子间静电排斥作用减弱,蛋白之间吸引力增大相互聚集引发沉淀。根据不同蛋白质有不同的等电点这一特性,依次改变蛋白质溶液的pH值,可分步将不同的蛋白质沉淀析出,从而达到分离纯化的目的。例如胰岛素的蛋白粗提液,先调节pH值至8.0去除碱性蛋白质,再调节pH值至3.0去除酸性蛋白质即可达到工业生产的目的。
大多数蛋白质的等电点在偏酸性范围内,例如血清蛋白的等电点PI为4.9,脲酶的等电点PI为5.0。所以该方法具有调节pH所需的无机酸价格低、操作比较方便等优点。但是很多蛋白质的等电点比较接近,对低pH敏感的目的蛋白,应避免使用此法。此方法常与盐析法、有机溶剂沉淀法等方法连用,提高蛋白质收率,很少单独使用。
(四)非离子多聚物沉淀法
非离子多聚物自上世纪60年代得到应用以来,至今已经发展成为分离生物大分子的重要沉淀剂,并逐渐广泛用于酶或核酸的分离纯化。非离子多聚物可以沉淀和分离血纤维蛋白、免疫球蛋白、细菌和病毒。常用的非离子多聚物有聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖等。以聚乙二醇的使用为例,一般使用分子量为4000以上的聚乙二醇(PEG),最常用的PEG的分子量有6000和20000。聚乙二醇(PEG)具有无毒、不可燃、操作条件温和,简便、沉淀比较完全并且对蛋白质有一定的保护作用等优点。PEG沉淀蛋白质的机理,到目前为止仍不太清楚,有研究指出PEG分子在溶液中会形成网格状结构,蛋白质分子会与该结构发生空间排斥作用进而凝聚,被沉淀下来。
影响非离子多聚物沉淀的因素有:蛋白质的分子量、浓度、溶液的pH、温度以及PEG的平均分子量等。蛋白质的分子量越大,沉淀蛋白质所需要的PEG浓度越小,蛋白质越易于沉淀;蛋白质浓度不宜太高,小于10mg/mL的蛋白质溶液比较适合;蛋白质溶液的pH值接近蛋白质等电点时易于被沉淀,所需PEG浓度也较低,此法应在较低的温度下操作,一般温度控制在3℃以下,但是操作时需考虑该温度下目的蛋白是否稳定;高分子量的PEG利于蛋白质沉淀,但是PEG的分子量过高也会造成溶液黏度大,不利于操作,常用的PEG浓度为20%左右。
(五)选择性沉淀法
蛋白质受不同物理因素或化学试剂影响稳定性不同,利用这一特性可以有选择地将蛋白沉淀,此法称为选择性沉淀法。影响蛋白质稳定性的因素有温度、pH值、有机溶剂等。改变上述条件使杂蛋白发生变性沉淀,而目的蛋白不形成沉淀,就可达到分离纯化的目的。
1.利用蛋白对热的稳定性不同进行沉淀 加热有时可破坏杂质蛋白,而不破坏目的蛋白,依此原理可以除去杂蛋白。将样品溶液升温至45~65℃,杂蛋白会在不同温度下沉淀。保温一定时间,杂蛋白会最大程度地形成沉淀,而目的蛋白的活性损失最少。需要注意的是,45~65℃时多数蛋白酶都比较稳定,所以操作时应适当加入蛋白酶抑制剂,避免样品中目的蛋白发生酶解而失活。
2.利用酸碱变性进行沉淀去除杂蛋白 在pH值上升到5.0时,大多数蛋白质会被沉淀,而少数蛋白质会在中性或碱性条件下形成沉淀。如果目的蛋白在中性或碱性条件下才会被沉淀下来,就可以利用pH值的变化去除杂蛋白。例如:用2.5%三氯乙酸处理胰蛋白酶、抑肽酶或细胞色素C粗提液,均可除去大量杂蛋白,而对目的蛋白的活性没有影响。很多细菌蛋白质的等电点在5.0左右,所以该法更适用于重组蛋白质的初步纯化。调节适当的pH值可以先除去溶液中的杂质蛋白。常用醋酸、柠檬酸或碳酸钠调节pH值,也可采用高氯酸、三氯醋酸等强酸。10%的三氯醋酸可以沉淀大部分蛋白质,20%的三氯醋酸可以沉淀分子质量低于20000的蛋白质。需在冰水浴中操作,采用强酸进行分离时需要注意安全。
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