现代分离分析技术可广泛应用于具有物理或化学性质差异的药物的分离分析。但是由于手性药物的两个对映异构体物理和化学性质几乎完全相同，只有旋光性不同，所以利用常规分离分析收到无法实现对它们的分离。只有采用适宜的具有手性识别能力的方法，或使它们转变为具有明显的物理和化学性质差异的非对映异构体，才能实现对手性药物的两个对映异构体的拆分。

现代色谱分离分析技术在对映体的分离与测定方面显示出巨大的优越性。常用的手性药物测定技术有高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）、毛细管电泳（HPCE）、超临界流体色谱（SFC）等，其原理在第二章作过介绍。

色谱法（TLC、GLC、HPLC和HPCE等）分离2-APA类药物对映体，对药物质量控制、立体选择性的药理学和毒理学的研究都是十分重要的手段，既可用于常规样品或生物样品的分析，也适用于制备小量样品；具有简便快速、分离效果好和光学纯度高等优点。

7.3.3.1 液相色谱法

手性高效液相色谱技术是20世纪70年代后期发展起来的，特别适用于极性强、热稳定性差的手性药物的分析。HPLC拆分对映体有直接法和间接法两种：其中直接法又分为手性固定相法（CSP）和手性流动相添加剂法（CMPA）；间接法即手性衍生化试剂法（CDR）。

1.手性固定相法

手性HPLC中，手性固定相是实现对映体拆分的基础，并有多种类型。手性固定相可以根据其化学类型分类为“刷型”手性固定相、手性聚合物固定相、环糊精类手性固定相、大环抗生素手性固定相、蛋白质手性固定相、配体交换手性固定相、冠醚手性固定相等。

“刷型”手性固定相是20世纪60年代由Pirkle等人发明的HPLC中非常重要的一类手性固定相。常见的有3，5-二硝基苯甲酰（DNB）氨基酸类CSP，DNB是作为接受π-π键相互作用的重要基团。这类Pirkle型CSP一般不适于直接分离胺、酯和羧酸类对映体，而将它们转化为酰胺衍生物则较易分离。特别是用（R）-N-（3，5-二硝基苯甲酰）苯甘氨酸[（R）-DNBPG]键合在γ-氨基丙基二氧化硅载体上CSP，广泛用于分离2-APA酰胺对映体，流动相常用正己烷-异丙醇，必要时用乙腈作改性剂，根据3种作用力（芳基间π-π作用、酰胺偶极间静电作用和氢键作用）相互作用模式，可推断（S）-（+）-构型先流出。徐诗伟等人在研究微生物酶不对称水解（±）-布洛芬酯生成（S）-（+）-布洛芬时，用共价型（R）-DNB-PG CSP柱有效分离布洛芬N-N-（二苯基）酰胺对映体，分离因子（α）1.27，分离度（Rs）1.47，10min内完成分离。Gasparrini等用（1R，2R）-N，N′-（3，5-二硝基苯甲酰）二氨基环己烷[（R，R）-DNB DACH]CSP柱进行HPLC拆分8种2-APA类药物[布洛芬、萘普生、非诺洛芬、氟比洛芬、弗诺洛芬、酮洛芬、噻洛芬酸（Tiaprofenic acid）和舒洛芬（Suprofen）]的N-（1-萘基）-酰胺对映体。除舒洛芬（α为1.10）部分分离外，其余均达到基线分离，α在1.23～1.83之间，洗脱次序与（R）-DNB-PG CSP的一致。

手性聚合物固定相包括两类不同来源的聚合物。一类是天然的多糖衍生物，包括纤维素和直链淀粉。另一类是合成的高分子化合物。纤维素和直链淀粉可直接或经衍生后用作HPLC的手性固定相。纤维素和直链淀粉是D-葡萄糖以β-1，4-糖苷键或α-1，4-糖苷键相连而形成的线型聚合物，由于葡萄糖单元的手性，每个聚合物链均具有沿着纤维素主链存在的一个螺旋形的沟槽。对映体进入沟中，主要通过吸引和包合作用实现对映异构体的拆分。

纤维素和淀粉的手性识别能力的不同，主要在于其葡萄糖单元的构象差异。纤维素及淀粉手性固定相的优越之处在于：具有良好的稳定性，制柱简单，无需键合；适用于多种手性药物的拆分，尤其是含芳香环药物的拆分；对醇、酸、酮、酯、含磷或硫的药物或手性中间体均有良好的手性识别能力。如可用于噻洛芬酸的手性拆分。

利用手性色谱柱Chiralcel OD，则可同时对萘普生和萘普生酯对映体在正相条件下（正己烷和异丙醇作为溶剂）进行有效的拆分。

手性聚合物固定相商品柱主要是日本Daicell公司制造的Chiralcel柱。

还有其他一些分析方法。用α1-酸性糖蛋白（AGP）和β-环糊精（β-CD）键合微粒硅胶制成CSP，可不衍生直接分离2-APA类药物的对映体。AGP CSP商品名Enantiopac，其溶质保留和立体选择性可用叔胺如N，N-二甲基辛胺（DMOA）加入流动相中进行调节。用Enantiopac柱直接测定血浆中布洛芬、酮洛芬和非诺洛芬对映体浓度可供临床手性药动学的研究。

β-CD CSP商品名CyclobondⅠ，用它测定生物体内布洛芬对映体，流动相0.1%三乙胺乙酸盐缓冲液（pH值为7.5）∶乙腈=70∶30，灵敏度0.1μg/m L。此外，还可用人血清蛋白（HSA）制成的新型蛋白CSP直接拆分一些2 APA类药物，取得了较好结果。近期报道用固定化青霉素酰化酶（PGA）作手性柱可直接拆分酮洛芬。(www.daowen.com)

2.手性试剂衍生化法

手性衍生色谱一般是用手性胺或醇将2 APA衍生为非对映的酰胺或酯，然后利用非对映体的物理化学性质差异以常规色谱法分离。

在测定生物体内的布洛芬对映体代谢作用时，用L（-）-薄荷醇与布洛芬衍生为非对映体酯，可在HPLC Partisil（10μm）柱上得到分离，流动相为正己烷-乙醚（100∶1）。

7.3.3.2 其他色谱方法

除了最常用的HPLC方法之外，毛细管电泳、手性超临界流体色谱、气相色谱等均可对2-芳基丙酸进行有效的拆分。

1.毛细管电泳

毛细管电泳（CE）手性分离技术的发展为极性大、热稳定性差和非挥发性手性药物的拆分提供了经济有效的手段，受到普遍重视，并得到了快速发展。

毛细管电泳具有以下优点：手性选择试剂主要为直接加入，操作简单；手性选择剂消耗少，运行成本低；分离效率高；分离模式多样。

2.手性超临界流体色谱

采用CO2等超临界流体为流动相的超临界流体（SFC）或次临界流体（Sub FC）色谱兼具GC和HPLC的优点，可以使用GC和HPLC的各种检测器进行分析和测定，在20世纪80年代中期得到迅速发展。然而，其内在的方法与技术缺陷使其发展与应用受到了限制。尽管如此，SFC在手性分离甚至制备方面仍有其独特的应用。

二氧化碳是SFC常用的流动相，具有低的临界温度和压力，可以和大多数GC和HPLC的检测器相匹配，毒性低、费用较低，加入有机改性剂可分离离子性、强极性的化合物。

手性SFC分析方法多来源于GC和HPLC，相应的手性SFC方法主要为手性毛细管柱SFC和手性填充柱SFC，而手性流动相法使用较少。

与LC相比，由于超临界流体的低黏度性质，在相同的保留时间内，SFC的分离度更大、理论塔板数更高；在相同的分离度下，SFC的分离时间更短；而且SFC还降低了有机溶剂的消耗量。例如，利用环糊精聚硅氧烷键合固定相可对布洛芬进行有效的拆分。