7.2.4.1 技术路线

黑曲霉转化阿魏酸生成香草酸是两步法微生物产生香草醛的第一步。黑曲霉具有将阿魏酸转化成香草酸的能力，底物阿魏酸的利用率高，微生物菌种相对容易筛选，而且黑曲霉不含有对阿魏酸作用生成不溶性聚合物的漆酶。

7.2.4.2 产酶微生物与产酶菌种选育

1.产酶菌株选育方法

（1）微生物培养基及产酶条件。

1）斜面培养基，马铃薯浸汁（20%）900m L，葡萄糖20g，琼脂20g，pH值自然。

2）基本培养基（g/L），麦芽糖20，酒石酸二铵1.8，磷酸二氢钾0.2，硫酸镁0.5，酵母膏0.5，氯化钙1.3mg，盐酸硫胺素2.5mg。

3）培养基灭菌条件，0.1MPa，20min。

（2）培养条件。

1）斜面培养，30℃，5d。

2）产酶培养与转化。向基本培养基中接入2×105个/m L的分生孢子，装液量100m L/250m L三角瓶，摇床转速120r/min、30℃培养72h后，再向培养液中加入10 g/L的阿魏酸钠盐10m L，形成约1g/L的底物浓度进行转化，跟踪取样测定。

2.产酶菌株选育

孙志浩等人转化筛选了转化阿魏酸生成香草酸的菌株。考察了实验室所保藏的17株真菌，每转化24h取样1次，共取5次，分别代表24h、48h、72h、96h和120h的转化结果。所取转化液用0.45μm的微孔滤膜过滤，澄清液用等体积的乙酸乙酯萃取后，用薄层色谱分离，碘蒸汽显色，斑点用铅笔标记后复印薄板所得的结果加以比较，根霉几乎没有转化阿魏酸能力，有些米曲霉、红曲霉具有转化阿魏酸生成香草酸的能力，而黑曲霉菌株几乎都有转化阿魏酸能力。黑曲霉（6276、SW-33和SW13-1）生成香草酸的量较多。

对3株黑曲霉6276、SW-33和SW13-1进行复筛，由于SW13-1生成香草酸的速度太慢，发酵时间比SW-33要多36h，故选择SW-33。

7.2.4.3 产酶发酵工艺

1.工艺流程

香草醛及其提取

2.菌种培养与扩大

（1）种子培养基（g/L），麦芽糖20，酒石酸二铵1.8，磷酸二氢钾0.2，硫酸镁0.5，酵母膏0.5，氯化钙1.3mg/L，盐酸硫胺素2.5mg/L。

（2）发酵培养基（g/L），麦芽糖15，酒石酸二铵1.82，酵母膏3，磷酸二氢钾0.2，七水硫酸镁0.5，氯化钙1.32mg/L，盐酸硫胺素1mg/L。pH值为5.0。

（3）种子培养，挑菌落于种子培养基，30℃、170r/min摇床培养72h，装液量100m L/250m L三角瓶。

（4）发酵培养，在发酵培养基中接入10%种子液，37℃、150r/min摇床培养72h，装液量100m L/250m L三角瓶。

（5）发酵罐条件，25L不锈钢机械搅拌罐装液量15L，接种量10%，罐温37℃，罐压0.1MPa，搅拌速度200r/min，通风量（VVM）1∶1。

3.发酵工艺条件(www.daowen.com)

（1）培养基确定。培养基对菌体的生长至关重要，菌体生物量的不足必然会导致酶活水平无法体现与提高。优化培养基组分是选择既利于菌体生长又利于菌体转化产香草酸的培养基。

1）碳源筛选。选择麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉、丙二醇、甘油、乙醇、乳糖9种常见碳源，测定其对黑曲霉的生物量的影响，丙二醇、甘油、乙醇、乳糖根本不适合菌体的生长，选出麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉这5种碳源进行复筛。麦芽糖为碳源时阿魏酸的转化率最高。

2）氮源初筛。对NaNO3、NH4Cl、NH4NO3、（NH4）2SO4、酒石酸二铵、草酸二铵、尿素、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、酪蛋白、豆饼粉13种氮源进行筛选，对酵母膏、豆饼粉、酒石酸二铵、尿素4种氮源进行复筛，最终HPLC测定的结果显示酵母膏的效果最明显，且在36h达到产物的最高峰，选其作为合适的培养基氮源。

对培养基各组分进行单因素含量试验，得出含有15g/L麦芽糖、1g/L酵母膏、1mg/L盐酸硫胺素为好。

（2）发酵条件确定。

1）发酵培养基初始pH值对香草酸生成的影响。将发酵培养基用缓冲液配成不同的pH值，10%接种量，发酵48h，再各加入0.1g的阿魏酸转化48h后，取样用HPLC测定，发酵初始pH值对转化过程有一定的影响，但影响不大，可知较适宜的pH值为5.0。

2）温度对香草酸生成的影响。不同温度下发酵48h，加入阿魏酸进行转化，37℃时产物的浓度较高，采用其作为合适的发酵温度。

3）通气对香草酸生成的影响。在250m L三角瓶中装不同体积装液量的发酵培养基，进行底物转化实验。试验表明装液量120m L最好。用250m L三角瓶中装液120m L，在不同的摇床转速下培养并进行转化，摇床的转速对香草醛的生成有明显的影响。

培养条件优化后转化产香草酸的浓度从0.332g/L，提高得到0.455g/L，相应摩尔转化率为57.81%。转化48h后底物已基本消耗完毕，除生成的香草酸以外，还有一定量的副产物杂质生成。

（3）25L发酵罐中黑曲霉发酵试验。黑曲霉SW-33在25L机械搅拌罐中的菌体生长和发酵pH值—时间曲线表明，黑曲霉的种子接入发酵罐中发酵0～40h内菌体量增长很快，之后略有下降，发酵pH值一直保持缓慢下降，表明菌体代谢正常进行。取样观察，发酵液清亮，菌球多而细小，嫩黄色，直径在1～2mm左右，有一部分呈松散的丝状，生长到48h时，加入10g底物阿魏酸，加入底物阿魏酸后，在转化30h内pH值一直保持稳定而缓慢地下降，菌体量基本保持稳定，取样观察，菌球形态未发生改变，但颜色由嫩黄色变为白色，转化液清亮并可闻到香草酸特有的气味。76h后菌体量开始下降，菌球数量明显减少，菌丝呈絮凝状，pH值也不再下降，反而略有上升，表明发酵已到终点。

从加入底物阿魏酸开始计时，转化过程持续34h，在加入底物后15h内没有香草酸生成的迹象，底物的消耗也很少，这与摇瓶中的现象吻合，即黑曲霉中转化阿魏酸生成香草酸的酶是诱导型酶，需要在加入底物诱导10～20h内才产生出来。到34h时，已有超过96%的底物阿魏酸被消耗，生成香草酸的浓度达到0.52g/L。

7.2.4.4 转化工艺

1.工艺流程

2.底物阿魏酸钠盐的制备与添加方法

先配制0.1mol/L的NaOH溶液，经过精确滴定，每1g阿魏酸需要用66m L的碱溶液中和至中性，将底物配制成10g/L的钠盐溶液，经微孔滤膜无菌过滤后，避光保藏待用。

底物阿魏酸的添加方法如下：精确称取阿魏酸晶体，制成10g/L的钠盐水溶液，用移液管精确吸取，在无菌操作条件下加入到培养基中，稀释到1g/L的浓度。

3.游离细胞转化

对黑曲霉SW-33转化阿魏酸的粗酶作用最适合的pH值进行研究，得出pH值为6的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液比较合适。同时证实转化阿魏酸为香草酸的酶是诱导酶，受底物阿魏酸诱导，诱导浓度以10g/L比较合适。

4.固定化细胞转化

对黑曲霉菌体细胞进行固定化的尝试，比较了卡拉胶包埋法、海藻酸钠包埋法和明胶包埋法进行固定的固定化细胞，其中海藻酸钠包埋法固定细胞的形状和硬度比较好。用3%的海藻酸钠包埋固定1g菌丝体，包埋量为2%，加入到20m L 1g/L的阿魏酸溶液中进行转化，转化时间为24h，共做10批。结果看出，在前7个批次的转化过程中，固定化后的菌体细胞还是可以保持比较稳定的酶活，但转化率仅为10%左右，维持在较低水平。

研究表明，菌体包埋后转化阿魏酸生成香草酸的速度有所降低，但产生的香草酸没有迅速被菌体代谢掉。通过菌体包埋量试验得出，随着菌体包埋量的增加转化率增大，当包埋量大于15%时，转化率接近游离细胞水平。