7.2.3.1 两步法生物转化阿魏酸生成香草醛技术路线

两步法生物转化法是先用一株菌转化阿魏酸生成香草酸，再用另一微生物将得到的香草酸转化为香草醛的方法。其转化关系见图7-5。

图7-5 两步法生物转化阿魏酸生成香草醛

法国Lesage-Meessen等人建立的两步法（1944年），先用黑曲霉（A.niger）转化阿魏酸生成香草酸，再用朱红密孔菌（P.cinnabarinus）将得到的香草酸转化为香草醛。这样，一方面解决了朱红密孔菌转化过程中所造成的阿魏酸的损失，另一方面还保留了朱红密孔菌可以转化阿魏酸生成香草醛的能力和朱红密孔菌具有天然香荚兰在肉桂酸类衍生物的代谢上类似的特点。用A.nigeⅠ-1472转化阿魏酸生成香草酸的摩尔转化率为88%，产香草酸920mg/L，将此香草酸富集培养液加到生长3d的P.cinnabarinus MUCL39532发酵液中，转化7d，香草醛达到最大值237mg/L，摩尔转化率为22%。Estelle Bonnin（1999年）等又用富集纤维二糖的甜菜糖浆和商业品纤维二糖作为朱红密孔菌的碳源，分别使香草醛的产量提高了3.3倍和3倍，副产物甲氧基氢醌的产量降低了2.2倍，香草醛最高产量为725mg/L，摩尔转化率为55.6%。1999年，J.Oddou等研究了朱红密孔菌（P.cinnabarinus）MUCL39533高密度培养，通过采用葡萄糖-磷脂培养基使香草醛的产量达到760mg/L，摩尔产率为61%。另外，Olivier Bernard等对朱红密孔菌（P.cinnabarinus）MUCL39533对在生物反应器中由香草酸生产香草醛的物料平衡模型进行了研究。Christlle Stentelaire等（2000年）进行了P.cinnabarinus MUCL39533由香草酸生产香草醛的实验室规模放大研究，得出机械搅拌罐生产香草醛的产量高于气升罐，在机械搅拌罐中生长阶段需要最大通气比为0.83VVM，而在产物形成阶段需要最小通气比为0.28VVM，此时产香草醛1260mg/L。当在琼脂培养基中香草醛浓度超过1000mg/L时，对朱红密孔菌（P.cinnabarinus）的生长产生很高毒性，通过添加选择性树脂XAD-2限制了香草醛产生对菌体的毒性，并减少了副产物如甲氧基氢醌的形成，使香草醛的产量达到1575mg/L，摩尔转化率为52.8%。目前采用朱红密孔菌两步法生产香草醛所报道的最高水平是在2L的反应器中7d产香草醛1.6g/L，相应的摩尔转化率为80%左右，平均每天的产生能力是225mg/（L·d）。

目前，我国在这方面的研究也取得了成功，江南大学生物催化研究室于2000年开始进行以阿魏酸为前体的两步法微生物生产香草醛的研究，已筛选到将阿魏酸转化为香草酸的黑曲霉（A.niger）SW33和将香草酸转化为香草醛的朱红密孔菌（P.cinnabarinus）SW0203，在25L规模下可产香草醛1.46 g/L，摩尔转化率为70%，并申请了专利。2003年通过了浙江省新产品鉴定，已达到国外同类研究先进水平。

7.2.3.2 两步法生物转化所用微生物与酶

两步法生产香草醛是研究较早且报道较多的香草醛生产方法。第一步是将阿魏酸转化为香草酸，所用微生物主要是黑曲霉（如A.niger MIC373），可将5.5 g/L阿魏酸转化为3.6 g/L香草酸；A.nigerⅠ-1472转化阿魏酸生成香草酸的摩尔转化率为88%，产香草酸920 mg/L。A.niger SW-33可转化1 g/L的阿魏酸钠盐底物，生成香草酸的浓度达0.52 g/L，摩尔转化率为73%。西唐链霉菌（S.setonii）ATCC25497也可将0.88g/L阿魏酸转化成0.332g/L香草酸（WO 9608576），微生物中参与转化的酶主要是阿魏酸脱羧酶（ferulic acid decarboxylase）。

第二步是用子囊菌（Ascomycetes）、担子菌（Basidiomycetes）或放线菌（Actinomycetes）等微生物将香草酸转化成香草醛。常用的担子菌属的朱红密孔菌（P.cinnabarinus），如P.cinnabarinus MUCL38467可转化0.941g/L香草酸生成0.481g/L香草醛；P.cinnabarinus MUCL39533最高产香草醛量达到1.575g/L，摩尔转化率为52.8%。Nidula niveo-tomentosaATCC38357可转化1.252g/L香草酸生成0.444g/L香草醛。黄孢原毛平革菌（Pharerochacte chrysosprium）MIC247可转化1.2g/L香草酸产0.628g/L香草醛。Micromucor isabellinus26h转化2.87g/L香草酸产1.96g/L香草醛。曲霉（Aspergillus fumigatus）转化1.68g/L香草酸为1.09g/L香草醛（WO 0050622）。诺卡菌（Nocardia sp.）NRRL5646中含香草酸羧酸还原酶，将香草酸还原为香草醛，但香草醛继续还原为香草醇。国内P.cinnabarinus SW-0203产香草醛1.40g/L，摩尔转化率为70%。

香草酸的转化是氧化还原反应，需要辅酶的参加，反应的酶因微生物不同而异，包括：香草醛脱氢酶（vanillin dehydrogenase，EC1.2.1.67），催化反应为vanillate+NADH=vanillin+NAD++H2O；羧酸还原酶（carboxylic acid reductase，EC1.2.2.30），催化反应为：香草酸+ATP —→香草酸-AMP+PPi+NADPH→—香草醛+NADP+H2O。但生成的香草醛会被细胞内其他酶的作用降解，这是两步法制备香草醛含量较低的原因，因此控制转化参数十分重要。(www.daowen.com)

7.2.3.3 原料阿魏酸

阿魏酸由于与香兰素的化学相似性，而被认为是种很有前途的前体物质。该物质大量存在于谷糠、甜菜浆等农业废料中，从中提取阿魏酸用来发酵生产香兰素可大大提高谷物与甜菜等农产品加工的综合利用率。

1.阿魏酸在植物中的分布

阿魏酸是木材、草和谷壳中含量极大的一种肉桂酸衍生物，它同各种碳水化合物以共价键相连，经碱水解可从谷壳中释放出来。植物细胞壁中含有较多的阿魏酸，在小麦中含0.5%（质量分数，干重），在大麦中含0.14%（质量分数，干重），在单子叶植物、热带草和竹子中含量为3%（质量分数，干重）。农业和工业副产品，如麦麸、米糠、碱油饼、玉米黑油和甜菜糖浆等，均含有数量不等的阿魏酸，其中麦麸中的含量最高，达3%（质量分数）。

2.阿魏酸在植物中的存在形式

阿魏酸多与果胶的中性侧链的α-L-阿拉伯糖的C-2或β-D-半乳糖的C-6以酯键相连。部分阿魏酸或经单体间的氧化、以脱氢二聚体的形式存在，或经阿魏酸和香豆酸的光化学反应、以环二聚体的形式存在，如吐雪酸和古柯邻二酸。谷物中的细胞壁多聚糖阿糖基木聚糖由β-1，4-六环木糖聚合物构成骨架，木糖单位的C-3或C-2原子上常被α-L-阿糖呋喃残基替代。阿魏酸则与阿糖基木聚糖中阿糖呋喃残基以酯键连接。

3.阿魏酸的获得

通过化学法或酶的水解作用，可以让植物中结合的阿魏酸游离出来，经过提取后可获得作为底物的阿魏酸，例如甜菜糖浆中含有约1%的阿魏酸。在欧盟各国，甜菜精制工业每年产生的甜菜糖浆，是生产阿魏酸的廉价原料。直接以甜菜糖浆作为底物或从中制得的可溶性阿魏酰聚糖作为底物，通过阿魏酰酯酶的作用，释放出游离阿魏酸。另一类富含阿魏酸的植物是我国传统中药材当归、川芎等，它们常被用于生产药物，其中的有效成分就包含阿魏酸。目前，由于采用生物转化法转化阿魏酸生产香草醛的研究有了较大的突破，对天然植物中阿魏酸的提取成为研究的热点，同时关于各类植物细胞中阿魏酸含量、结构与作用的研究也正在进一步进行之中。