生物法生产香草醛在生产周期和规模扩大方面要优于植物提取法，生产成本低于植物提取法，而在产品品质上要优于化学合成法，目前已成为消费者欢迎、生产商追求的热点。

7.2.2.1 生物香兰素的制备方法

据FDA规定，只要原料是天然的，通过生物催化法（酶作用）获得的香料就是天然的。生物香兰素的制备方法主要有微生物法、酶工程法和细胞工程法等。从技术可行性、经济性、安全性等方面考虑，认为以目前的条件，采用微生物法制取香兰素更为实际。许多细菌、霉菌和酵母都可以用阿魏酸（ferulic acid）、丁子香酚、异丁子香酚、香草醇（vanillyl alcohol）、香草胺（vanillylamine）、松柏醇（coniferyl alcohol）、黎芦醇（veratryl alcohol）等化合物为前体生产香草醛，主要制备方法有以阿魏酸为前体的一步法和两步法，以及以丁子香酚、异丁子香酚为前体的酶法制备方法。

1.以阿魏酸为前体的生物转化生产香草醛

瑞士奇华顿罗亚（Givaudan Roure）公司的Muheim等人通过从自然界中分离降解阿魏酸和异丁子香酚的微生物，筛选到一株理想的香草醛产生菌西唐链霉菌（Streptomyces setonni）ATCC39116，建立了从阿魏酸生产香草醛的一步发酵转化方法。西唐链霉菌只积累200mg/L的香草酸，然后以香草醛作为代谢溢出产物积累，并同时产生愈创木酚。在摇瓶试验中，产生香草醛6.4g/L，摩尔产率达68%。放大到10L发酵罐水平时，流加22.5 g/L阿魏酸，17h可转化产生13.9 g/L的香草醛，摩尔转化率为75%。进一步扩大到340L发酵罐规模，用20.75 g/L阿魏酸，25.5h可产9 g/L的香草醛，摩尔转化率为51%。该方法的成功之处在于该微生物菌株对香草醛的耐受性高，培养液中香草酸比香草醛出现得早，但香草酸只积累到一定程度，细胞调节机理倾向于积累香草醛，积累得香草醛浓度可以接近其在20℃的结晶浓度（1%）。

德国哈尔曼-赖默（Haarmann Reimer）公司的Rabenhorst与Hopp等筛选了另一株理想的由阿魏酸生产香草醛的产生菌株拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）HR167（DSM9991及DSM9992），在10L发酵罐规模下，32h可转化19.92 g/L阿魏酸生成11.5g/L香草醛，摩尔转化率为77.8%。另外，德国Cheethan也发现恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）能在112h内将阿魏酸转化为2.247g/L香草醛，摩尔转化率73%。

1991年，法国国家农业研究所（Institut National de la Recherche Agronomique）的Gross等研究发现朱红密孔菌（Pycnoporus cinnabarinus）CNCMn DEGⅠ-937或CNCMnDEGⅠ-938可以代谢阿魏酸生成香草醛，但香草醛的产量很低（转化0.3g/L阿魏酸产0.045g/L香草醛，摩尔转化率为20.5%），同时该菌也可将香草酸转化为香草醛，转化率为35.1%。法国Falconnier等（1994年）研究了朱红密孔菌（Pycnoporus cinnabarinus）Ⅰ-937的阿魏酸代谢途径，该菌经6d生长，在培养基中香草醛的最大浓度达到64mg/L，对阿魏酸的摩尔转化率27.5%。在整个生物转化过程中阿魏酸侧链氧化裂解为香草酸，香草酸进一步脱羧为2-甲氧基氢醌，同时还发现两条还原途径：阿魏酸被还原为松柏醇和香草酸还原为香草醇，并且在代谢的过程中，阿魏酸会被菌体产生的漆酶作用生成水不溶性的聚合物，从而导致香草醛的产量很低。

为了提高香草醛的产量，法国国家农业研究所的Lesage-Meessen等对转化方法进行了改良，发现黑曲霉具有将阿魏酸转化为香草酸的能力，并且不会产生较多的杂质，同时，黑曲霉菌体内也不存在漆酶，由此建立了两步法转化生产香草醛的工艺。该法先用黑曲霉将阿魏酸转化为香草酸，再用一株漆酶缺失的朱红密孔菌将香草酸还原成香草醛。

两步法生成香草醛由于模仿了香荚兰中降解阿魏酸衍生物产生香兰素的生物过程，因而研究报道比较多。Lesage-Meessen等进行了深入研究，通过采用富含纤维二糖的甜菜糖浆、葡萄糖磷脂培养基，选用选择性树脂XAD-2方法吸附培养基中的香草醛，以及采用朱红密孔菌高密度培养、降低溶解氧浓度，采取高CO2产生、低比生长速率等条件，使香草醛的浓度提高至1.575 g/L，摩尔转化率达到52.8%。

2.以丁子香酚、异丁子香酚为前体转化生产香草醛

Abraham W.R.等最早（1988年）报道发现黑曲霉（Aspergillus niger）ATCC9142可将异丁子香酚转化为香草醛，但由于香草醛能继续转化为香草醇或香草酸，因而产率极低，转化率只有10%。Yoshimoto等发现假单胞菌（Pseudomonas sp.）TMY1009的苯乙烯双氧酶可将苯乙烯和异丁子香酚转化生成香草醛。(www.daowen.com)

1991年Rabenhorst等研究了沙雷菌（Serratia）及肠杆菌（Enterobacter）转化丁子香酚或异丁子香酚生产香草醛。其中用黏质沙雷菌（Serratia marcescens）DSM 30126转化9d可得到的香草醛浓度为3.8 g/L，摩尔转化率为20.5%。但是1993年Markus等重复了这一过程，未得到相同的结果，而他们发现用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和脂氧合酶（sigma L8383）却可转化异丁子香酚生成香草醛，摩尔转化率低于20%。

1993年Washisu Yukilo等发现一株几乎不能在香草醛、香草酸或香草醇的存在下生长，但可利用丁子香酚的假单胞菌（Pseudomonas）诱变株TK-2101（菌株编号FERM P12689，保存于日本工业微生物技术研究院），在0.3%（体积分数）丁香酚的存在下，该菌72h可转化得到0.46g/L香草醛。

1994年，Hopp等分离到一株新的假单胞菌（Pseudomonas sp.）HR 199（DSM 7.62或DSM 7.63），该菌株可在32.5h将6.5g/L的丁子香酚转化成2.365g/L的阿魏酸、1.314g/L的香草酸、1.458g/L的松柏醇和0.011g/L的松柏醛，香草醛并不积累。但是，Overhage J等通过在香草醛脱氢酶作为的基因中插入一个ω因子使该菌的香草醛脱氢酶活性下降，选育到一株能以异丁子香酚作为惟一碳源生长并产生大量香草醛的Pseudomonas sp.HR199（工程菌），在10L规模下转化25.3g/L丁子香酚产2.6g/L香草醛，摩尔转化率为12.4%。

另外，Chatterjee T等1999年报道用红球菌（Rhodococcusrhodochrous）将15%的异丁子香酚以58%的转化率转化为香草醛。

除了微生物制备香草醛的研究外，人们还利用酶工程和细胞工程的手段研究生物香兰素的制备方法。例如德国Markus报道用50mg脂氧合酶（sigma L8383），转化50m L50%（体积分数）异丁子香酚溶液，4h可得1.14g的香草醛，对应的浓度为22.8 g/L。又如Robert等发现香草醇氧化酶（VAO）能以很高的产率将甲氧甲酚和香草胺转化为香草醛，由于红辣椒的辣椒素能经酶法水解转化为香草胺，因此由香草胺生成香草醛有一定的潜力。国内外有不少研究者利用香荚兰植物组织进行了细胞培养生产香兰素，如Havkin-Frenkel等研究了用不同的香荚兰植物（V.planifolia）通过组织培养合成香荚兰香精的主要组分。此外，Rao Sathuluri（2000年）还报道利用游离或固定化辣椒细胞（Capsticum futescens cell）从原儿茶醛及咖啡酸生产香兰素。

7.2.2.2 国内外生物香兰素研究专利概况

“生物香兰素”的制备研究始于20世纪80年代。在研究的初期，研究人员用分析代谢产物的方法研究了各种微生物菌株（如假单胞菌、大肠杆菌、诺卡菌、凝结芽孢杆菌、啤酒酵母、朱红密孔菌、西唐链霉菌、茄病镰孢霉等）对可转化为香草醛的物质（如木质素、阿魏酸、香草酸、丁子香酚、异丁子香酚、芳香族氨基酸和葡萄糖等）的代谢途径。

微生物降解阿魏酸的途径大致有7类，代谢产物基本上是香草醛、香草酸、香草醇、原儿茶酸、甲氧基氢醌等，其中假单胞菌、丛毛单胞菌、西唐链霉菌、洋葱假单胞菌、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌、假单胞菌和拟无枝酸菌以香草醛为代谢终产物；香草酸的降解代谢途径约有5种，只有诺卡菌、朱红密孔菌、黄孢原毛平革菌、荧光假单胞菌的代谢过程涉及香草醛；有关丁子香酚或异丁子香酚微生物降解代谢的有4种，茄病镰孢霉菌可以将丁子香酚转化为香草醛和4-乙烯基愈创木酚，其他代谢中间产物主要是香草酸、阿魏酸、松柏醛、松柏醇等。

20世纪90年代以后，生物香草醛的制备方法研究取得进展，法国、德国、日本和瑞士等国家的一些研究小组，他们研究的微生物转化前体主要是阿魏酸和丁子香酚或异丁子香酚，转化的技术路线主要是阿魏酸为前体的一步法和两步法，以及以丁子香酚、异丁子香酚为前体的生物转化法。其中瑞士奇华顿罗亚公司（Givaudan Roure Int）和德国哈尔曼-赖默公司（Haarmann-Reimer Gmbh）研制的一步法、法国国家农业研究所Lesage-Meessen等研制的两步法较接近于工业生产。选育的有生产潜力的微生物有西唐链霉菌（Streptomyces setonni）ATCC39116、拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）HR167、黑曲霉（Aspergillus niger）Ⅰ-1472、朱红密孔菌（Pycnoporus cinnabarinus）MUCL39533等。丁子香酚或异丁子香酚转化法中研究假单胞菌和脂氧合酶较多，红球菌（Rhodococcusrhodo chrous）也可能会成为比较有前途的菌株。此外，日本Yoshida等研究的用固定化胺氧化酶转化香草胺连续生产香兰素的方法是一种很有前景的方法。

但到目前为止，国外还很少有工业化生产成功的报道。最近法国Rhodia公司等推出微生物转化阿魏酸生产的“生物香兰素”产品。国内在这方面还正处于起步阶段，江南大学孙志浩等也进行了阿魏酸为前体的两步法微生物产生香草醛研究，筛选了黑曲霉（A.niger）SW33和朱红密孔菌（P.cinnabarinus）SW0203，在25L规模下可产香草醛1.40 g/L。