7.1.5.1 前体化合物——苄基海因的制备工艺

已报道的5-取代海因的化学和合成方法较多，主要有Suzuki法、缩合加氢法和氨基酸关环法三种。

1.Suzuki法

Suzuki法是用醛、氰化钠和碳酸氢铵合成5-取代海因。该法的缺点是要使用剧毒物NaCN，这给安全操作、三废处理等方面带来困难，增加了成本，并且收率也不高。

2.缩合加氢法

缩合加氢法以海因为原料，将海因与醛缩合得到的5-不饱和取代海因，再经加氢生成5-饱和取代海因，途径见图7-1。该方法缩合收率均在95%以上，方法简单，在环保、产物收率等方面与Suzuki法相比有明显优势。

图7-1 5-饱和取代海因的合成路线

（1）5-不饱和取代海因的制备。海因是以5-位上的亚甲基与苯甲醛的羰基参与的羰-羰缩合反应，生成5-亚苄基海因。海因与芳香醛或杂环醛缩合反应的最佳催化剂是乙二胺，最佳反应时间位2～5h。亚苄基海因的摩尔收率达到95%以上。

（2）5-亚苄基海因加氢制备5-苄基海因。适量的5-亚苄基海因溶解于1mol/L NaOH溶液中，置于高压釜中，再加入用量为30%的Raney Ni催化剂，通H2在2.5k Pa和60～80℃下搅拌反应2～5h，反应结束后趁热过滤倾出物，调节pH值至7，得到产物沉淀，用水重结晶，过滤、干燥即得5-苄基海因。

3.氨基酸关环法

Courelius等发现α-氨基酸和氰酸盐能反应生成N-氨甲酰-α-氨基酸，经酸化关环后即可得到5-取代海因。

氨基酸关环法反应条件简单、收率高、产物纯度高，但需以能获得成本低廉的L-氨基酸或DL-氨基酸为前提，该法才具有通用性。

7.1.5.2 海因酶生物催化剂的制备

1.产酶菌种和特性研究

（1）产酶菌种。JS 01为南京工业大学实验室保存的菌种，具有D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸水解酶活力。经中国科学院微生物所鉴定，确认为属洋葱种伯克霍尔德（Burkholderia）。

（2）菌株的诱变。洋葱种伯克霍尔德（Burkholderia cepecia JS-01）已经证实可转化对羟基苄基海因（HPH）生成D-对羟苯甘氨酸（D-HPG）。以Burkholderia cepeciaJS-01为出发菌株，5-苄基海因（BH）转化成D-苯丙氨酸（D-Phe）的产物收率为筛子，对Burkholderia cepeciaJS-01进行了紫外诱变、5-氟尿嘧啶诱变和激光诱变。紫外诱变结合5-氟尿嘧啶梯度平板筛选菌种，可减少筛选工作量。所得突变株JS-01-44号对5-苄基海因的转化率提高到64.5%，连续10代斜面传代表明其酶转化活性稳定，其经50L发酵罐扩大培养也可保持62%左右的转化率。同时以JS-01-44号为出发菌株，采用200点Nd：YAG倍频脉冲激光诱变，经过粗筛及5代连续稳定性实验后，选育到一株高产菌Burkholderia cepecia 1003，转化率最高可达85.5%。

（3）菌株所含酶对底物的特异性。为考察诱变后的菌株Burkholderia cepecia 1003所含的D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酶对底物的特异性，进行实验。配制5-取代海因的混悬水溶液150m L。底物浓度为15g/L，调节pH值至9.0，按底物对菌体的质量分数为0.5加入菌体（菌体经不同的诱导剂诱导），用氮气置换出瓶中空气，密封，于摇床中38℃下转化70h后，分别用毛细管电泳测定转化液中各组分的含量。

2.发酵产酶工艺

考察了发酵培养基中各种碳源、氮源对菌体生长及产酶的影响，并在不同的发酵条件下对菌株生长及产酶进行了研究。

（1）培养基。①斜面培养基，蛋白胨1%，牛肉浸膏0.3%，NaCl 0.5%，琼脂1.5%，p H=7.4。②种子培养基，葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，玉米浆2.5%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.3%，KH2PO40.2%，MgSO40.025%，CoCl20.005%，p H=7.0。③发酵培养基，葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，玉米浆2.5%，NaCl 0.3%，KH2PO40.2%，MgSO40.025%，CoCl20.005%，p H=7.5。

（2）种子的培养。配制上述种子培养基在121℃下灭菌20min。冷却后接入种子，在32℃通风培养18h。

（3）发酵培养和菌体收集。配制上述发酵培养基3L于装5L的发酵罐中，121℃下灭菌20min。冷却后接入种子，然后在32℃通风培养20h。发酵液6000r/min离心20min，菌体备用。

7.1.5.3 酶法转化工艺

1.一菌双酶转化工艺

一菌双酶反应机理见图7-2。

图7-2 一菌双酶法反应机理(www.daowen.com)

（1）酶对底物的立体选择性依赖的研究。迄今为止的研究表明，以5-取代海因经酶转化为D-型产物的过程基本上是D-型异构体作为底物。实验表明，对含D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸水解酶的菌体而言，其对底物光学活性的这种选择性是由D-海因酶完成的。上述实验结果表明，体系中的D-海因酶有很强的立体专一性，它只能转化D-型取代海因，而不能转化L-型取代海因。

（2）利用菌体进行的酶转化。称取一定量的底物5-取代海因，加入适量的水，调节pH值，加入质量为底物2倍的菌体，用氮气置换出瓶中气体，然后迅速塞好瓶塞，将其置于摇床中转化。转化5-取代海因制备D-氨基酸的最适转化条件是：pH值为9.0～9.5，温度38℃左右，转化40～72h后测定反应液中的D-氨基酸含量。

2.一酶一树脂法制备工艺

由于双酶转化工艺中海因酶和氨甲酰水解酶的活性相差较大，一般前者的活性为后者的5倍以上，故为提高D-苯丙氨酸的最终产率，综合了海因酶的高效转化特性，发展了苄基海因经海因酶催化制备N-氨甲酰-D-苯丙氨酸、再经酸催化化学水解得到D-苯丙氨酸的化学酶法工艺，即一酶一酸法，该方法的不足之处是酸水解产生了大量的废酸、废盐，环保处理压力大。一酶一树脂法是一酶一酸法的改进方法，通过采用强酸性树脂代替强酸，可避免反应中大量产生盐，从而减轻D-苯丙氨酸的分离纯化难度。该方法国外Roche公司开展过研究。

（1）一酶一树脂法的反应机理。一酶一树脂法是通过D-海因酶将苄基海因转化得到N-氨甲酰-D-苯丙氨酸，然后在强酸性树脂和亚硝酸钠的作用下，将N-氨甲酰-D-苯丙氨酸脱氨甲酰获得D-苯丙氨酸。该工艺的特点是：主要利用D-海因酶的光学选择性，获得D-型中间体，然后采用温和的化学方法将中间体变为光学纯产物。其主要反应过程见图7-3。

图7-3 一酶一树脂法反应路线

（2）一酶一树脂法的制备工艺。取发酵所得菌体，在菌体和苄基海因比为1∶1（质量比）、底物浓度为20g/L、38℃、pH值为9～9.5的密闭、充氮气条件下转化24h，N-氨甲酰-D-苯丙氨酸的转化得率为80%以上，转化液调节pH值至2～3即得目标产物的白色沉淀。

称取一定量的N-氨甲酰-D-苯丙氨酸（20g/L）溶于水，加入一定量的强酸性阳离子树脂，5～15℃，调节pH值并滴加亚硝酸钠溶液（亚硝酸钠与N-氨甲酰-D-苯丙氨酸摩尔比为1.2∶1），滴加结束后继续反应2h，反应完成后将反应物直接上柱分离，以纯水洗杂、0.8mol/L的氨水洗脱，产物D-苯丙氨酸的得率在80%以上。

7.1.5.4 D-苯丙氨酸的分离提取工艺

1.分离工艺路线

2.菌体絮凝和过滤除菌体

在D-苯丙氨酸的提取过程中，体系中由于细胞自溶，存在较多杂蛋白，从而使得过滤除杂的速度及其缓慢。采用无机絮凝剂进行杂蛋白的絮凝，可提高过滤的速度。采用两组无机反应剂CaCl2、KH2PO4与CaCl2、K2HPO4进行多次实验，转化液调节pH值至5.5～6.0，静止1h，过滤去除菌体细胞，收集清液。实验结果表明两组反应剂对D-苯丙氨酸的影响都比较小，但是鉴于过滤速度和经济方面的考虑，通常选择使用后一组絮凝剂。

3.膜超滤去除蛋白

利用超滤膜（截留分子量10000）过滤，去除过滤液中的蛋白，收集清液。

4.溶液脱色和浓缩结晶

研究表明糖用活性炭对转化液的脱色效果最好，活性炭用量为1.5%，pH值为6.5左右，温度为80～90℃，脱色时间为30min。再调节pH值至5～6，减压蒸馏可得D-苯丙氨酸白色晶体

7.1.5.5 D-苯丙氨酸的分析检验和质量标准

（1）D-苯丙氨酸的定性分析。采用纸层析法，D-苯丙氨酸的Rf值为0.65，展开剂组成为正丁醇∶乙酸∶水=6∶2∶2，显色剂为1%的茚三酮正丁醇溶液。

（2）D-苯丙氨酸的定量检验。采用高效液相色谱法测定，色谱柱为C18柱，流动相为乙腈∶20mmol/L磷酸二氢钾∶磷酸=25∶75∶0.1。流速1.0m L/min，紫外检测器波长202nm。

（3）D-苯丙氨酸的质量标准。由于D-苯丙氨酸是一种中间体产品，目前主要用于医药的合成，故未见公认的质量标准，参照L-苯丙氨酸的质量标准，制定了以下D-苯丙氨酸的质量指标。

1）性状，白色晶体或结晶状粉末，微溶于水，不溶于醇。

2）含量，不小于98.5%。

3）比旋光度，=+33°～+35°（c=1，H2O）。

4）干燥失重，不大于0.2%。

5）重金属，不大于20mg/kg。