消旋化氨基酸的α-氨基经乙酰化（或羧基酰胺化）后，用蛋白水解酶如酰化酶、羧肽酶或胺肽酶等水解由L-氨基酸形成的酰胺键，将L-氨基酸游离出来，与不能水解的乙酰D-氨基酸实现分离。

7.1.2.1 酰化酶法

几乎所有氨基酸的酰基衍生物均可与氨基酰化酶作用而有选择性地脱乙酰基得到相应的光学纯的氨基酸，余下的对映体酰化氨基酸经水解也可得到相应的氨基酸。

最初Neuberg等用植物淀粉酶和动物肾组织中提取的酰化酶拆分了N-乙酰-DL-色氨酸；后来千畑一郎等用发酵培养的米曲霉或青霉菌中提取的氨基酰化酶拆分了多种氨基酸的酰化衍生物，以获得光学纯氨基酸。Tripathi等研究了从产碱杆菌属（Alcaligenes denitrificans和Alcaligenes faecalis）中诱导产生D-氨基酸酰化酶，利用培养产生的完整细胞可将各种N-乙酰-D-氨基酸转化为D-Met、D-Val、D-Phe和D-Leu。DPhe和D-Val的产率最高，分别为94.3%和84.7%，N-乙酰-D-亮氨酸和N-乙酰-D-缬氨酸是最适诱导剂。

王晓平等进行了米曲氨基酰化酶的纯化、固定化酶法拆分DL-Ala的研究工作，D-Ala的收率达到83.5%，并探索了其工业化生产的最适条件。刘尚珍等报道了固定化猪肾酰化酶的制备、性质、酶柱可连续地光学拆分乙酰-DL-丙氨酸，使用寿命可达30d以上。谢志东等利用猪胰脂肪酶在苯中实现了DL-苯丙氨酸酯的拆分，对DL-氨基酸而言，D-型收率达40%，L-型收率达30%，酶活回收率在95%以上。姚文兵等用从猪肾、牛肾中分离得到的氨基酰化酶来拆分DL-Ala制得D-Ala。牛肾氨基酰化酶的拆分率和D-Ala得率最高，分别为45%和42%，而猪肾氨基酰化酶分别为44.9%和33.1%。显然，牛肾氨基酰化酶比猪肾氨基酰化酶的拆分收率高。此法是目前国内厂家生产光学活性氨基酸的主要方法。

韩沾元等用米曲霉602菌种发酵后制备固定化酰化氨基酸水解酶。此酶对脂肪族和芳香族酰化氨基酸均有较快水解速度，重复使用后酶活力损失较少，对酰化氨基酸的立体专一性较高，已用于L-氨基酸和D-氨基酸的制备。从3.8kg乙酰-DL-色氨酸制得L-色氨酸1.14kg，收率为38%。从600g乙酰-D-色氨酸得到D-色氨酸320g，收率为64%。

廖本仁等在Donald方法的基础上，选择性水解了乙酰-DL-色氨酸。在酰基水解酶的作用下，可将其拆分成L-色氨酸和D-色氨酸，收率分别为40.9%（光学纯度为98.8%）和38.0%（光学纯度为99.2%）。

7.1.2.2 羧肽酶法

羧肽酶拆分原理与酰化酶一样。目前，应用此法获得D-氨基酸的最成功实例是荷兰DSM公司采用恶臭假单胞菌L-羧肽酶拆分DL-羧基酰化氨基酸。以生产半合成青霉素和头孢菌素类抗生素的重要侧链D-PG和D-p HPG。拆分过程中生成得L-型氨基酸继续酯化、酰胺化，再消旋后可被重复利用。不反应的D-型对映体可通过与等量苯甲醛形成水不溶酰胺的席夫碱复合物，再水解得D-氨基酸。(www.daowen.com)

Nakai Mamoru等报道，将DL-色氨酸转化为DL-色氨酰胺，用D-酰胺酶将D-色氨酰胺降解为D-色氨酸，提取出D-色氨酸。余下的几乎是纯净的L-色氨酰胺，再经化学水解可得到L-色氨酸。另一方面，也可以用L-酰胺酶将L-色氨酰胺降解为L-色氨酸，将L-色氨酸分离后，向余下的D-色氨酰胺溶液中加入HCl溶液，再加热水解3h、调节pH值至6.0，经冰浴冷却、过滤、干燥得到D-色氨酸，其收率为46%。

7.1.2.3 微生物或酶选择性降解法

Umemura等发现麦芽假丝酵母1504降解L-Ala的速率比降解D-Ala快10倍，可用来作为去除L-型异构体的生物催化剂。基于这一发现，他们开发了由麦芽假丝酵母不对称降解DL-Ala制备D-Ala的实用工艺。其最适降解条件为：温度30℃，pH值为6.0，通风和振荡（1200r/min）。在此工艺条件下，不对称降解DL-Ala（200g/L），L-Ala在40h内完全降解，D-Ala很容易从反应液中分离出来，最终可得到光学纯度为99.0%的D-Ala 90g，收率为45%。

Masaru等利用细菌与DL-氨基酸消旋体的作用，不对称降解L-氨基酸而获得D-氨基酸。以此法制备了D-Met、DVal、D-Leu、D-Ile和D-His，所制得的氨基酸都为100%光学纯。所用的细菌属于Proteus、Providencia、Micrococcus、Achromobacter等菌属。

Yamamoto等利用色氨酸酶降解DL-Trp中的L-Trp，产生吲哚、氨和吲哚丙酮酸，然后分离代谢物。由该法降解反应48h制得的D-Trp收率约45%，光学纯度为98.8%。很多L-氨基酸可用成本低廉的发酵法生产，所以，可以考虑用L-氨基酸作为酶法生产D-氨基酸的原料。先将L-氨基酸消旋成DL-型，再用酶选择性降解L-氨基酸，最后提取D-氨基酸。

Makoto Yagasaki等报道了用L-Glu、L-Pro制备DGlu、D-Pro的研究。他们用3g/L的TM93/p GAR1菌株湿细胞，在37℃、pH值为8.5的条件下，反应5h，将0.68mol/L的L-Glu完全消旋化，再用大肠杆菌ATCC11246菌株湿细胞（5g/L），在37℃、pH值为4.2时反应10h，生成0.34mol/L（50g/L）的D-Glu，分离精制后，D-Glu的光学纯度达99%。另外，在37℃、pH值为6.2的条件下，用大肠杆菌HB101/p PR3菌株的细胞（1g/L）将0.78mol/L的L-Pro完全消旋化，120℃下保温20min，灭活脯氨酸消旋酶，再在30℃、pH值为6.0的条件下用40g/L的假丝酵母（Candida sp.）PRD-234细胞反应40h，代谢掉0.43mol/L（50g/L）的L-Pro，D-Pro的收率为47%，光学纯度为99.5%。

由于消旋体氨基酸中含50%L-氨基酸，故不对称降解法制备D-氨基酸的理论收率只有50%。而且，L-氨基酸耗尽与否也直接影响产品的光学纯度。尽管该法有这些缺点，但由于简单易行，对于某些附加值高、难以用其他方法制备的D-氨基酸，仍可用此法，其前提条件是相应的L-氨基酸或DL-氨基酸应较易获得。