1.酶的柔性

用X射线晶体衍射法和傅立叶变换红外光谱（FTIR）法测定枯草杆菌蛋白酶在水和有机溶剂中的二级结构，发现在各种脱水有机溶剂如正辛烷、乙腈、环己烷中枯草杆菌蛋白酶的α-螺旋和β-折叠并无变化，可见有机溶剂对酶的二级结构无大影响。酶只有当其分子本身具有一定的空间构象时才能表现出催化活性，蛋白质分子即使为晶体时也处于不断的运动状态中，整个分子有相对刚性和柔性两个部分。为保证酶与底物的诱导契合，其活性部位保持一定的柔性是酶表现其催化活性所必需的。

酶分子的构象主要由静电作用力、范德华力、疏水作用以及氢键等作用构成一个复杂的网络来维持，其作用类似于润滑剂和增塑剂。酶与底物的结合是一个双方诱导契合的过程，在相互作用的过程中酶和底物都要作微小的构象变化。因此酶必须有一定的“柔性（flexibility）”，以使酶能趋向于最佳催化状态所需的构象变化。有机溶剂缺乏提供形成多种氢键的能力，不具备像水那样的调节功能。有机溶剂的介电常数一般较低，这往往会导致蛋白质带电基团之间更强的静电作用，使蛋白质的“刚性（rigidity）”增加，因而酶在脱水溶剂中比在水溶液中的活性低。事实上，酶之所以在有机溶剂（甚至是脱水的）中表现出催化活性，是因为它们能牢固地结合一些“必需水”（essential water），并保持它在催化反应中起调节作用。

影响酶催化活性的另一个因素是酶-底物过渡态的稳定性，酶分子动态结构的微小变化可能引起酶与底物、酶和底物过渡态中间物之间的作用发生很大的变化，从而导致酶反应速度急剧下降。例如，枯草杆菌蛋白酶和其他一些水解酶的反应过渡态是一个高极性的带电四面体，水比极性小的溶剂更能稳定这种四面体中间体，因此有机溶剂中的微量水将有利于酶-底物过渡态中间体的稳定。

2.结合水

酶催化反应是在环绕着酶分子表面的水层内进行的。所谓非水体系并不是绝对无水的，而是一种含有微量水的有机溶剂体系（W0＜1%）。在这种体系中，宏观上是有机溶剂，微观上是水体系。酶催化反应时，底物分子须先从有机相进入水相，然后才能与酶形成底物-酶复合物，继而发生反应。酶蛋白质分子表面含有大量带电基团和极性基团，在绝对无水条件下，这些带电基团因相互作用而形成“锁定”的失活构象。加入适量水充当润滑剂可使酶的柔性增大，维持酶的活性。生物反应体系中的水绝大多数（W0=98%）是作为真正的溶剂水（bulk water），而少部分的水紧密结合在酶分子的表面，并被称为结合水（bound water）。结合水的物理性质如熔点、热容EPR和IR的光谱特征与溶剂水不同。结合水对酶的结构和催化活性至关重要，因此结合水又称为结构水（structural water）或称必需水（essential wa-ter）。据此可以推测若用有机溶剂仅取代溶剂水而不取代结构水，将不会对酶的活性产生很大影响。

3.水活度

在非水介质中，只有在最佳水含量时，蛋白质结果的动力学刚性（kinetic rigidity）和热力学稳定性（thermodynamic stability）之间才能达到最佳平衡点，酶才表现出最大活性。Halling用热力学水活度αw（thermodynamic water activity）来描述有机溶剂中酶活性与水含量的关系。水活度是指在特定的温度和压力条件下，反应体系中水的摩尔分数xw与水活度系数γw的乘积，见式（6-1）：(www.daowen.com)

水活度系数γw是溶剂疏水性的函数，溶剂疏水性越大，γw越大。对给定的αw来说，疏水性溶剂所需的水量比亲水性溶剂的少。αw是一个强度性质的物理量。为了理解水活度的概念，Bell将αw比喻为温度，而将水含量比喻为热焓，两个反应体系可以有相同的温度或αw，但两者的热焓或含水量可以不同。在平衡状态时，反应体系中各组分（酶、溶剂、底物和产物等）的αw是相同的。

4.水活度与酶活性

酶活性与反应体系的αw直接相关，例如黑毛脂肪酶（Mucor miehei lipase）在αw=0.55时，在不同极性的溶剂中都表现出最高的酶活性，其中在正己烷溶剂中活性最强，有机溶剂中过多的水或过少的水都会影响酶活性。

R.Morrone等对不同来源的5种脂肪酶进行了研究，发现酶的催化活性与αw相关，但是不同酶在相同有机溶剂中的最佳αw值不同，这可能是由于酶分子结构的差异性所造成的。αw或水含量的增加会导致酶催化反应中某些底物Km值的增加，例如在二烷溶剂中，PEG修饰的枯草杆菌蛋白酶（PEG-subtilisin）催化丁酸乙烯酯与正己醇转酯生成丁酸己酯。由于在酯化反应中，水是一种抑制剂，它与底物竞争酰基-酶中间体，促进逆反应。因此，在有机溶剂反应体系中，亲核性试剂的Km会随着水含量的增加而增加，例如枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）对正己醇的表观Km随水浓度增加而增加，而酰化试剂丁酸乙烯酯的K m不受溶剂的影响。因此，αw值将影响水解酶催化酯化或转酯反应的平衡。

5.水活度缓冲体系

综上所述，水活度αw值对非水介质中生物催化反应有着重要的影响，体系中的水含量是由溶剂的极性所决定的，因此溶剂对酶的影响实际上是对酶结构水的影响。若结构水被溶剂剥夺，则酶的活性发生变化，酶反应必须在恒定的水活度下进行。一些盐具有固定的水合作用，因而能产生一个精确的水活度αw。因此，可利用饱和盐溶液通过气相平衡有机溶剂反应体系，以维持酶反应所需的水活度。在有机溶剂反应体系中安装聚硅氧烷管，管内循环通入盐溶液，聚硅氧烷表面只能允许水蒸气的通过，不允许离子的渗透，因此只有水能被转移，此法可用于保持反应体系的水活度。该方法的缺点是水的转移受到平衡装置的影响，若大规模使用，则必须对体系的水活度加以精确的调控。另一种方法是把水合盐添加到有机溶剂中直接作为αw的缓冲剂，在反应过程中，盐中的结晶水可释放而维持了反应所必需的微量水。含结晶水的盐起到了水活度的缓冲作用，以保持反应体系的αw值，有关饱和盐溶液及水合盐的水活度，见相关文献。