5.5.3.1 酶的定向进化的产生及定义

酶分子的定向进化又称蛋白质的定向进化。定向进化也称为试管进化，以区别于自然进化和人工进化，是模拟达尔文进化的、快速的、具有一定目的性的改造蛋白质的方法，是相对于传统的蛋白质改造的“理性设计”方法，该方法被称为蛋白质改造的“非理性设计”方法。它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，人为的创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需要的性能更加优良的酶或创造出自然界所没有的且具有优良性质的新酶。

酶的定向进化是近年兴起的一种有效地改造蛋白质的分子生物学手段，它研究的是所需生物体的特定的基因或蛋白质，而不是整个有机体。定向进化方法可以在体外改造酶基因，定向进化的主要目的是在短时间内，通过反复的突变/复制/筛选/选择过程，获取拟想筛选的得以提高的突变酶，即定向进化等于“随机突变+高通量筛选”，其过程主要包括：①通过随机突变和/或基因重组创造基因多样性，建立突变文库。②在适当生物体内建立表达于分析的突变体酶蛋白库。③高通量筛选检出由氨基酸置换而引起的预期形状改善，精确选取阳性结果，供进一步进化研究。

酶分子定向进化是从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。例如，在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Tap DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的特点，并控制突变库的大小使其与特定的筛选容量相适合，选择适当条件以较低的比率向目的基因中随机引入突变，进行正向突变间的随机组合以构建突变库，凭借定向的选择（或筛选）方法，选出具有所需性质的优化酶，从而排除其他突变体。酶的定向进化方法实用性较强，可以通过对编码酶的基因进行随机突变，进而改进酶的特性，因此所有酶的理性设计碰到的问题都可以通过定向进化的方法加以解决。定向进化的一般过程如下：

（1）基因的选择，选择编码所需蛋白质的DNA序列。

（2）突变或重组，通过易错PCR引入随机突变点或通过DNA改组等方法增加基因序列的多样性。

（3）突变基因文库的构建，将获得的突变重组基因插入到表达载体中构建突变库。

（4）突变体酶的表达，将载体转入受体细胞中表达变异酶。

（5）目的酶的鉴别，利用筛选和选择的方法确定有益的特性克隆。

（6）分离改良基因并重复上述过程，直至获得所需性质的蛋白质。酶的改造可抽象为以亲本序列为出发点，在多维蛋白质序列空间中搜索、寻找适合需要的蛋白质序列的过程。而活性比例较高的序列集合完全依赖于随机突变技术，以此方法进行“无理”蛋白质设计也取得了成功，特别是在经过多轮突变的例子中。然而，像有理设计一样，由于缺少重组，随机突变本身（例如，高突变菌种、易错PCR等）并没有完全体现进化的复杂性，多点突变不易重组导致无法有目的的检查功能序列空间。

5.5.3.2 定向进化方法

1.多样性与突变方法

定向进化中，多样性的源泉一般来自随机点突变。当建立一个单基因的随机点突变库后，通常所有的有活性的基因产物和起始序列差别1～3个氨基酸。更高的突变率将导致更高比例的无活性克隆。发表过的突变方法一般有低保真条件下的DNA复制和基因合成两类。

（1）低保真条件下的DNA复制。如典型的易错PCR，这种方法简单方便，但需维持基因密码子的自然特性，这限制了每个密码子突变仅能产生5～7个氨基酸取代，另外加上终止密码子的限制，可接受的突变率为每个基因突变产生2个氨基酸的取代。

（2）基因合成。由于合成寡核苷酸价格的下降，对普通研究人员来说合成方法更易获得突变基因。这些合成方法其操作不受终止密码子的限制并且不受任何位置的影响，可选择性地在特定位置对氨基酸区域进行操作。(www.daowen.com)

Straregene公司构建了缺失DNA修复3个途径的大肠杆菌菌株XL1-Red，该菌株发生了mutS（错配修复易错）、mut D（DNA聚合酶Ⅲ3′→5′核酸外切酶活性缺失）和mut T（不能水解8位氧代d GTP）3个突变，因此它的基因随机突变率比亲本菌株高约5000倍。只要用含待突变目的基因的大肠杆菌表达质粒转化XL1-Red，培养到静止期后大概平均每2kb碱基序列会产生一个碱基突变，将质粒提出来转化正常的表达宿主，即可建立目的基因的随机突变库。这种方法的优点在于实验操作相当简便。

Bornscheuer等将含野生型假单胞荧光菌（Pseudomonas fluorescens）酯酶基因的大肠杆菌表达质粒转化到XL1-Red中，每培养24h取少量接种到新鲜的培养基上，同时提取质粒，7d为1个突变周期，用每次抽提的质粒转化DH5α，然后筛选阳性克隆。得到的阳性克隆再进入下一轮循环，得到的突变体改变了酯酶的立体专一性。

2.易错PCR

PCR扩增基因的复制过程，会不可避免地发生点突变，若使用二价锰离子代替二价镁离子作为DNA合成酶的激活剂可以使错误率提高。这就容易产生随机突变，这种方法被称为“易错PCR（error-prone polymerase chain reaction，e p-PCR）”。在采用Tap DNA聚合酶扩增目的基因时，通过改变反应条件，例如提高镁离子的浓度、加入锰离子、改变体系中4种d NTP的浓度等，改变基因扩增的突变频率，可以实现每个基因2～5个碱基替代的平均突变水平，从而在目的基因中以一定的频率随机的引入突变构建突变基因库。通过控制锰离子的量可以将错误率控制在0～10%之间，即在相应的蛋白质中使每100个氨基酸有10个氨基酸发生改变。由于易错PCR只能使原始蛋白质中很小的序列空间发生突变，突变库经筛选得到的改良突变子可以再进行下一轮的易错PCR，反复进行随机的突变，使正向突变逐步得到积累，直到获得所需突变酶。

3.DNA改组

定向进化的现代化开始的标志是Stemmer发明了DNA改组。DNA改组译自“DNA shuffling”，shuffling一词也有译为洗牌、重洗、重排、混组、混编的，有人为了表达得更确切，称之为“DNA改组重排”。这一技术模仿了自然进化模式，超越了以前的方法。

典型的DNA改组方案是用超声波或DNaseⅠ将DNA的起始分子剪切成50～100bp大小的片段，然后用凝胶纯化，在没有引物的情况下进行40～60个循环的PCR扩增。通过自身引导退火片段，使DNA链增长，在下一个PCR循环中扩增。全部扩增突变体产物可通过传统的PCR（有引物）循环和凝胶纯化回收，克隆到目标载体中。

将相关的DNA序列随机打断，然后使这些片段互为引物在DNA聚合酶的作用进行下链式延伸重组成为嵌合基因库，重组过程中的突变率在一定的程度上可控。当与选择压力或筛选过程结合后，编码所需功能的子代序列就被鉴别出来。所需克隆可被反复选育，产生有多种有利突变的后代，直到进化序列含有所需功能。

通过同源重组或者分子嵌合将多个不同来源DNA片段连接起来的方法被称为DNA改组。它可以从建立的文库中得到性能改善的突变体，这类似于基因系统中的交换操作。最普通的改组技术是利用PCR反应条件去进行不同起始基因间的交换。

4.酶法体外随机-定位诱变

为解决空间结构未知的酶的蛋白质工程问题，吉林大学张今等曾经以胰岛素样人参多肽基因和天冬氨酸酶基因为模型，探索出了一条酶体外诱变的新途径，即酶法体外随机-定位诱变（random-site-directed mutagenesis）。该方法的本质与酶的体外定向进化类似，对目的基因既采用随机突变增加突变位点，以快速产生优质酶，又让其突变受到一定的限制，以减少筛选突变体的工作量。实际上，该法也是体外模拟自然进化，其不同点在于，该法是通过控制DNA合成的底物种类和浓度比例实现碱基对的错配的。

5.5.3.3 定向进化的发展

酶的定向进化最初的尝试始于20世纪60年代，Sol Spiegelman成功的在分子水平上定向改造了RNA噬菌体复制酶Q，模拟了自然进化过程。真正意义上的进化出现在20世纪80年代早期，1981年B.G.Hall等定向改造了大肠杆菌K12中的第2半乳糖苷酶的底物专一性，利用LacZ缺陷性的菌株为宿主，从自发突变库中成功筛选到了可以水解乳糖、乳果糖、乳糖酸等的突变体酶，而野生型的酶则不能水解这些底物。1992年，H.Gram等利用噬菌体展示技术筛选抗体时，为了向抗体的轻链和重链中引入突变而使用了易错PCR技术。DNA改组方法最初时由PP.Jone1988年在研究小鼠的H-2同类株B10.CAS2的W17的E BetaⅡ类组织相容性基因时提出来的，1994年，由Stemmer将其引入到酶的定向进化中，利用DNA改组方法他对β-内酰胺酶进行了改造，得到了酶活力提高32000倍的突变体。

定向进化在短短的20多年的发展中已成为蛋白质和多肽的改造技术，正成为获取生物催化剂的新手段。