理论教育 优良菌种的选育和生物催化反应

优良菌种的选育和生物催化反应

时间:2023-11-03 理论教育 版权反馈
【摘要】:诱变育种就是利用各种被称为诱变剂的物理因数和化学试剂处理微生物细胞,并提高基因突变频率,在通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。

优良菌种的选育和生物催化反应

从自然界筛选得到的天然菌种(野生株)的生产性能一般比较低下,大多不符合生产菌种要求。随着微生物遗传学的快速发展,微生物发酵工业优良菌种的人工选育已经成为基本的操作技术。优良菌种的选育为生产提供了各种类型的突变株,大幅度提高了菌种的活性与生产水平。特别是基因工程细胞工程和蛋白质工程等定向技术的发展,使菌种的选育技术不断更新,使生物催化剂的优化与改造成绩斐然。

自然选育、诱变选育、抗噬菌体菌种的选育、杂交育种、原生质体融合技术、基因工程技术、分子定向技术等都被用于优良产酶菌种的选育。

5.4.2.1 自然选育

未经人工处理,利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。一般认为自然突变由两种原因引起,即多因数低剂量的诱变效应和互变异构效应。所谓多因数低剂量的诱变效应,是指有自然环境中存在的低剂量的宇宙射线、各种异构效应是指4种碱基第6位上的酮基或氨基的瞬间变构,所引起的碱基错配。例如胸腺嘧啶(T)和鸟嘧啶(G)能以酮式或烯醇式出现,胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)能以氨基式或亚氨基式出现。平衡倾向于酮式或氨基的,因此DNA双链中以A—T和G—C碱基配对为主。单在偶然的情况下,当T以烯醇式出现的瞬间,DNA链正好合成到这一位置上,以T配对的就不是A,而是G。若C以亚氨基式出现的一瞬间,新合成的DNA链这一位置上,与C配对的就不是G,而是A。在DNA复制的过程中发生的这种错误配对就有可能引起自然突变。这种互变异构现象是无法预测的,大量的统计分析表明,这种碱基对偶然错误配对引起自然突变的概率为1×10-9~1×10-8

自然突变可能会产生两种截然不同的结果,一种是菌种退化而导致目标产物产量或质量下降,另一种是对生产有益的突变。为保证生产水平的稳定和提高,应经常地进行生产菌种自然选育,以淘汰退化的菌种,选出优良的菌种,此所谓菌种“复壮”。

自然选育是一种简单易行的选育方法,可以达到纯化菌种、防止菌种退化、稳定生产、提高产量的目的。但自然选育的效率低,因此经常与诱变选育交替使用,以提高育种效率。

自然选育的一般程序是将菌种制成菌悬液,用稀释法在固定平板上分离单菌落,在分别测定单菌落的生产能力,从中选出高生产能力菌种。

5.4.2.2 诱变育种

微生物在长期的进化的过程中,形成了一套严密的代谢调控机制。其自身代谢过程是被严格调控的,并且还存在着代谢产物的分解途径,所有的代谢产物都不会过量积累。因此从自然环境中分离所得菌种的生产能力有限,一般不能满足生产的实际需要。诱变育种是提高菌种生产能力、提高产酶水平和代谢产物积累量的有效方法之一。

1.诱变育种的原理

诱变育种的理论基础是基因突变,突变主要包括染色体畸变和基因突变两大类。染色体畸变指的是染色体或DNA片段发生缺失、异位、到位、从复等;基因突变指的是DNA中的碱基发生变化即点突变。诱变育种就是利用各种被称为诱变剂的物理因数和化学试剂处理微生物细胞,并提高基因突变频率,在通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。常用的各种诱变剂包括物理性、化学性和生物性三大类。

2.诱变育种的基本方法

诱变育种一般包括诱变和筛选两部分,诱变部分成功的关键包括出发菌株的选择、诱变剂种类和剂量的选择及合理的使用方法的选择。筛选部分是通过初筛和复筛来测定菌种的生产能力。诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复,直到获得高产菌株。

(1)出发菌株的选择。用来进行诱变的出发菌株的性能对提高诱变效果和效率十分重要。诱变出发菌株要有一定的目标产物的生产能力,例如,欲提高产酶菌种的酶活,首先要求出发菌株有产该酶的能力。若出发菌株对诱变剂敏感,则变异幅度会大些。另外,还需要了解用于诱变的出发菌株的产量(酶活)、形态、生理等方面的情况。也可选择曾经过诱变处理的菌株,这样的菌株对诱变剂的敏感性会有所提高。

(2)诱变剂的使用方法。在所谓诱变育种中,诱变方法可以是使用单一诱变剂处理。对野生菌株单一诱变剂处理有时也能取得好的效果;但对经过多次诱变处理的老菌种,单一诱变因素重复处理,效果甚微,可以采用复合诱变剂处理来提高诱变效果。复合诱变剂处理是指用两种以上的诱变剂处理菌种。复合诱变处理包括同一诱变剂多次处理、两种以上诱变剂先后分别处理和两种以上诱变剂同时单次或多次处理。例如,青霉素的选育中先用不足以引起突变的氮芥短时处理,再用紫外线处理,可使诱变频率大大提高。其他如乙烯亚胺和紫外线、氯化锂和紫外线的复合处理,都是常用的方法,也有一定的效果。

(3)诱变剂的剂量选择。对不同的微生物使用的剂量不同,诱变剂的剂量与致死率有关,而致死率又与诱变率有一定的关系。因此可用致死率作为诱变剂剂量选择的依据。一般来说,诱变率随诱变剂剂量的增加而提高,但达到一定程度后,再提高剂量反而使诱变率下降。因此近年来已将处理剂量从过去的致死率99%~99.9%降至70%~80%甚至更低。但诱变剂剂量也不宜过低,较高剂量诱变可使一些细胞的细胞核发生变异,也可导致另一些细胞核破坏,引起细胞死亡,形成较纯的变异菌落。并且较高剂量可引起细胞遗传物质发生难以恢复的巨大损伤,促使变异菌株稳定,不易产生回复突变。

5.4.2.3 突变菌株的筛选

诱变处理后,正向突变的菌株通常为少数,须进行大量的筛选才能获得高产菌株。通过初筛和复筛后,还要经过发酵条件的优化研究,确定最佳的发酵条件,才能使高产菌株的生产能力充分发挥出来。经诱变后,菌种的性能有可能发生各种各样的变异,如营养变异、抗性变异、代谢变异、形态变异、生长繁殖变异和发酵条件(如温度)变异,这些变异的菌种可用各种方法筛选出来。

1.营养缺陷型突变菌株的筛选

营养缺陷型突变菌株的诱变育种具有重要的理论研究和工业应用价值,已广泛地在氨基酸、核苷酸生产中得到应用。在营养缺陷型突变菌株中,生物合成途径中的某一步发生了酶缺陷,合成反应不能完成,末端产物不能积累,因此末端产物的反馈调节作用被解除。只要在培养基中限量加入所要求的末端产物,克服生长障碍,就能使中间产物积累。(www.daowen.com)

在直链式第二氨基酸、核苷酸食物合成途径中,营养缺陷型突变菌株只能积累中间产物,而不能积累终产物。在分支代谢途径中,筛选的营养缺陷型突变株是通过解除协同反馈调节,使另一支代谢途径中的末端产物得到积累。而遗传障碍的不完全突变即渗透型突变,是一种酶活性下降的突变,不是完全丧失酶活性,因此不会过量积累末端产物,可避免反馈调节作用,大量积累中间产物,这种突变菌株在不添加相应物质的培养基上形成很小的菌落。

营养缺陷型突变菌株具有明显的遗传标记,在杂交育种中作为出发菌株,有利于杂交重组的分析,也可以作为基因工程中的受体菌,检出克隆基因的表达。

2.抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选

末端产物的反馈调节在生物合成途径中是普遍存在的,除了采用筛选营养缺陷型突变菌株来降低末端产物的浓度外,更加有效的方法是筛选抗阻遏和抗反馈抑制突变株。这两种突变均属于代谢失调,它们有共同的表型,即在细胞中已经有大量的末端产物时,仍不断合成这一产物。但其代谢失调的原因不同,其原因可能是因为体积基因或操纵基因发生突变,使产生的阻遏蛋白不再能和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因,因此不再起反馈阻遏作用,也可能是由于编码酶的结构基因发生突变,使变构酶不再具有结合终产物的能力但仍具有催化活性,从而解除了反馈抑制。

通常抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株是通过抗结构类似物突变的方法筛选出来的。结构类似物与末端产物有相似的结构,能与阻遏蛋白或变构酶结合,阻止产物的合成,引起反馈调节作用。但结构类似物不能代表末端产物参与生物合成,浓度也不会降低,因此它们与阻遏蛋白或变构酶的结合也是不可逆的。未突变的细胞因代谢受阻,不能合成某种产物而死亡。抗反馈调节突变菌株则在结构类似物存在下,仍可合成末端产物形成菌落。为了稳定抗结构类似物突变株,可在培养基中加入适量的结构类似物或抗生素,防止回复突变。

另外,也可从营养缺陷型的回复突变菌株获得抗反馈抑制突变株。营养缺陷型突变株是由对反馈调节作用敏感的酶钝化或缺失等原因所致,发生回复突变后,虽然酶的催化活性恢复了,但酶的结构发生了改变,对反馈调节作用不敏感,因此可过量积累末端代谢产物。

3.组成型突变株的筛选

在酶法生产中,常采用向发酵培养基中分批限量加入诱导物的方法,以提高诱导酶的活性。为解除对诱导物的依赖,可通过诱变改变菌种的遗传特性,筛选组成型突变株。突变发生在调节基因或操纵基因部位,都可以获得组成型突变株。筛选的方法是设计某种有利于组成型菌株生长并限制诱导型菌株生长的培养条件,造成组成型菌株生长的优势或使用适当的分辨两类菌落的方法,选出组成型突变菌株。

例如,在培养基中加入抑制诱导酶合成的物质,使组成型菌株处于选择优势。以β-半乳糖苷酶为例,将诱变处理后的菌种培养在含有抑制物邻硝基-βD-岩藻糖苷和乳糖的培养液中。在这种培养液中,β-半乳糖苷酶的合成被抑制,因此诱导型菌株不能利用乳糖,则不能生长。而组成型菌株能够合成β-半乳糖苷酶,可利用乳糖生长,使组成型菌株被富集。

交替培育法是将诱导型菌株经诱变处理后,先在含诱导剂(如乳糖)的培养液中培养,由于组成型菌株不需要诱导物就能合成β-半乳糖苷酶,以便利用乳糖,因此组成型菌株会先于诱导型菌株开始生长,在一段时间内,组成型菌株的菌数会增加很快。当诱导型在诱导物的诱导下合成β-半乳糖苷酶,开始利用乳糖生长时,就将细菌全部转入葡萄糖培养基中,在葡萄糖培养基两类细菌同样生长繁殖,但是组成型菌株仍能够合成β-半乳糖苷酶,而诱导型菌株的β-半乳糖苷酶合成停止,并且酶活力逐丧失。这时再将全部的细菌转入乳糖培养基中,组成型菌株又获得一次优势生长。如此反复多次后,组成型菌株的数量大大超过诱导型菌株,然后再用平板培养基分离出组成型菌株的单菌落。

通过显色反应也可以在平板上识别组成型菌株。其方法是在不含诱导物的平板上进行培养,由于组成型菌株能产生酶,培养后加入适当的底物反应。常采用经酶转化后有颜色变化的底物,以便快速检出组成型菌落。如用邻硝基苯半乳糖苷(o-nitropheny-D-galactoside,ONPG)来筛选β-半乳糖苷酶组成型突变株,刚果红可使纤维素水解纤维素露出的还原基团被染色,可用于筛选纤维素酶组成型突变株等。

4.抗性突变株的筛选

抗性突变株的筛选包括对抗生素、金属离子、温度、噬菌体等的抗性(或敏感)突变株的筛选,这些突变型菌株常用来提高某些代谢产物的产量。

(1)抗生素抗性突变。各种抗生素对微生物代谢的抑制机制各不相同,利用这些不同的机制改变微生物的代谢,可使某些产物过量积累。在抗生素产生菌的选育中,筛选抗生素抗性突变株,可明显提高抗生素的产量。例如,解烃棒杆菌(C.hydrocarbaclastus)产生的棒杆菌素(corynecin)是氯霉素的类似物,抗氯霉素的解烃棒杆菌突变株棒杆菌素产量比亲株要高出3倍。衣霉素可改变细胞的分泌能力,有助于胞内物质分泌到胞外,是因为它可以抑制细胞膜糖蛋白的合成。筛选枯草芽孢杆菌的衣霉素抗性突变株,使α-淀粉酶的年产量比亲株提高了5倍。蜡状芽孢杆菌的抗利福平无芽孢突变株的β-淀粉酶产量提高了7倍,主要是因为利福平可抑制芽孢的形成,使芽孢形成的时间延迟,有利于β-淀粉酶的分泌。

(2)抗噬菌体菌株的选育。噬菌体的感染常给工业生产造成巨大的损失,而且噬菌体很容易发生变异,使对噬菌体具有抗性的菌株失去抗性,所以需要不断选育新的抗性菌株。有研究表明,细菌对噬菌体的抗性是基因突变的结果,这种抗性可以发生在接触噬菌体以前,与噬菌体的存在与否无关。抗噬菌体菌株的筛选可采用自然选育和诱发突变选育两种方法。自然突变是以噬菌体为筛子,在不经任何诱变的敏感菌株中筛选抗性菌株,但抗性突变的频率很低。为了提高效率,可先进行诱变处理,再用高浓度的噬菌体平板筛选抗性菌株。噬菌体感染的筛选过程也可以反复多次,使敏感菌株裂解,从中筛选出抗性菌株。

(3)条件抗性突变。条件抗性突变也称为条件致死突变,其中温度敏感突变常可提高产物的产量。如适于在中温条件下(如37℃)生长的细菌,经诱变后获得的温度敏感突变菌株只能在低于37℃的温度下生长。这主要是因其某一酶蛋白结构改变后,在高温条件下丧失了活力。若此酶是某蛋白质、核苷酸合成途径中所需的酶,该突变株在高温下的表型就是营养缺陷型。谷氨酸产生菌——乳糖发酵短杆菌2256经诱变后获得的温度敏感突变株,在30℃条件下培养能正常生长,40℃条件下死亡,能在富含生物素的培养基中积累谷氨酸,而野生型菌的谷氨酸合成却受生物素的反馈抑制。

(4)敏感突变。柠檬酸经顺乌酸酶催化,转化为异柠檬酸。生产上为了提高柠檬酸的产量,必须抑制顺乌酸酶活性,防止异柠檬酸的产生。氟乙酸可抑制顺乌酸酶活性,通过诱变处理造成催化结构基因的突变,有可能造成酶活力下降,那么此菌株必然对氟乙酸更加敏感,即不足以抑制野生菌顺乌酸酶活力的某一氟乙酸浓度,就会对突变型产生抑制作用。如解脂假丝酵母IFO143用亚硝基胍诱变处理,获得的突变株S-22对氟乙酸表现出极大的敏感性,其顺乌头酸酶活力仅为野生菌株的1%,产柠檬酸与异柠檬酸的比例为97∶3,大大提高了柠檬酸的产量。

(5)生产上长期使用诱变剂处理,会使菌种的生活能力逐渐下降,如生长周期延长、孢子量减少、代谢减慢、产量增加缓慢,因此有必要利用其他方法如杂交育种的方法,提高菌种的生活能力。杂交育种的目的是将不同菌株的遗传物质进行交换、重组,使不同菌株的优良性状集中在重组体中,克服长期诱变引起的生活能力下降等缺陷。通过杂交还可以扩大变异范围,改变产品的产量和质量,甚至创造出新品种。由于多数微生物尚未发现有性世代,因此直接亲本菌株应具有适当的遗传标记,如颜色、营养要求(即营养缺陷标记)或耐药性等。有关杂交育种及其他细胞水平、分子基因水平的育种技术,可参考相关专著。

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