5.3.8.1 从土壤和水样中提取DNA

生态学家研究自然环境中微生物群体采用16 Sr RNA序列分析法，取得有关系统进化的结果。但环境中存在的微生物仅有极少数能被分离培养。为了取得能代表自然环境多样性的微生物样本，必须从环境中抽取生物群体DNA，通过适当剪切，经克隆建成文库，从而获得丰富的多样性的资源。

从土壤和海水浮游微生物中提取DNA已有成熟方法。土样DNA可采用回收细胞和裂解或者直接裂解的方法，用碱性缓冲剂抽取。所得DNA必须再经纯化，去出腐殖酸物质。从100g土样中获得1mg经纯化的DNA，足够进行多样性的比较研究。

从海水中抽取微生物群体DNA需采集几十升水样，先经不同滤器除去真核细胞，再经微孔滤膜收集原核细胞，膜上细胞可用1%SDS抽取其DNA。

由上述方法从土样中或其他环境中抽取到的DNA是各种微生物的混合DNA，其多样性是复杂的。有人对土壤DNA多样性进行了细致的考察，将已纯化的DNA变性后，在一定的缓冲液浓度、特性温度等条件下进行复性，用分光光度计测定50%单链复性所需要的时间，用C0t1/2表示，C0代表DNA的浓度（mol/L），t以秒计。用大肠杆菌DNA、小牛胸腺DNA及从同一土壤样品中分离出来的206株细菌的总DNA为对照进行复性实验，开发未培微生物资源涉及的技术包括：PCR分析、原位荧光杂交（fluorescent in site）、微自动放射自显影技术、寡核苷酸排列（oligonucleotide array）、偏基因组（metagenomic）、体外转录（in vitro transcribed）、r RNA（r DNA）技术等。从未培养微生物资源中发现与筛选新酶的过程：土样 —→分离去除细菌 —→分离收集DNA片段 — →用限制酶剪切DNA —→PCR扩增 —→克隆到BAC 载体内 —→转化培养微生物（大肠杆菌）—→筛选转化株 —→ 功能基因 —→新酶。

5.3.8.2 土壤微生物DNA文库的构建

1998年美国Wisconisin大学的学者与一家制药公司开始了土壤DNA文库的构建。他们从波士顿附近的土样中抽取DNA，再将大片段DNA（100～300kb）插入载体中，再转化到大肠杆菌体内，获得重组文库并将土壤微生物群体的基因组命名为偏基因组（metagenome）(www.daowen.com)

将土样中不能培养的微生物DNA的大片段（50kb）连接于BAC载体中，再用重组载体转化大肠杆菌。美国Wisconisin大学的学者从所构建的偏基因组文库中找出100多个16Sr RNA基因，显示序列丰富多样性，其中有的与已知细菌群相近，但大部分的序列代表了未经鉴定的细菌。通过将70个序列组成系统进化树，在片基因组中已鉴定出24种已培养过的菌株，更多的尚未培养、未经识别的菌种66种。他们从文库中筛选生物活性物质，获得能抗细菌、抗真菌、具有活性力及能产生铁载体的克隆。4个抗细菌活性克隆之一产生一种色素，经鉴定证明类似于靛红素，这是一种具有抗血病的活性物质，发现的另一个活性物质是酪氨酸激酶抑制痕剂。

近年来，未培养微生物的研究取得了一些发展，从环境中取得的样品中含有的微生物群落的总DNA可以直接进行提取。现在，从天然群落中提取染色体DNA已经发展出很多。当前，另一个受关注的研究热点是在微生物群落中仅占少数的微生物检测方法，只有将样品标准化后，才能检测出这些微生物的DNA。

从两个极端环境（南极洲海水和黄石公园温泉）中分别获得的样品中提取了环境总DNA克隆，然后对其中的Sr RNA基因进行了序列分析，发现序列同源性很低，这也证实了以前一直存在的一个观点，即还未培养的微生物中存在着很大的生物多样性。这个研究结果也说明了，可培养的微生物并不是环境中占主体的微生物，这就给用富集培养进行筛选的方法提出了更大的挑战。

从环境中提取的总DNA可以用PCR技术对已知基因进行检验。这种技术对模板DNA的质量要求很高，这是因为PCR技术对环境中污染带来的干扰很敏感。环境总DNA也可以用放射形同位素或荧光标记的DNA探针进行杂交检测。或者，将环境的总DNA用限制性内切酶切割成较小的DNA片段，把这些DNA片段克隆到表达宿主如大肠杆菌中，然后用筛选已分离微生物的一些技术，对分离的DNA克隆进行新酶基因的筛选。

但是，所有这些分子生物学手段的筛选原理是相似的，也存在一个很大的缺陷。这些筛选手段的有效运用都依赖于与数据库中各种已知数据的对比。由于现在的基因组测序计划所提供的DNA序列数据中有70%以上的基因是不清楚其功能的，所以可供筛选新酶的范围还是很大的。

不管是使用传统的微生物筛选方法还是较新的分子筛选方法，检测和筛选微生物多样性和基因多样性，是没有很大差别的。现在，可供选择的资源是很丰富的，在生物催化剂的发现与筛选中，工业条件下的酶学特性仍是筛选中至关重要的因素。