水解酶（hydrolases，EC 3.×.×.×）是最常用的生物催化剂，占生物催化反应用酶的65%。它们能水解酯、酰氨、蛋白质、核酸、多糖、环氧化物和腈等化合物。生物催化剂的水解反应类型见第三章，其中酯酶、脂肪酶和蛋白酶是生物催化手性合成中最常用的水解酶。

酶催化底物水解反应的机理与底物在碱性条件下的化学水解反应机理很相似。丝氨酸型水解酶活性中心的Asp、His、Ser组成三联体，其中丝氨酸的羟基作为亲核基团向底物酯或酰氨中的羰基碳原子发起亲核进攻，形成酶-酰基中间体，见图4-7（a）；然后其他亲核试剂（水、胺、醇、过氧化氢等）进攻酶-酰基中间体，酶将酰基转移到酰基受体上，酶自身恢复原形，见图4-7（b）。

图4-7 丝氨酸型水解酶的催化机理(www.daowen.com)

微生物脂肪酶（lipases）在水解反应中使用较多，而猪肝酯酶（pig liver esterase，PLE）和马肝酯酶（horse liver esterase，HLE）使用相对较少，这些酶对羧酸酯具有高度的立体选择性。而乙酰胆碱酯酶（acetylcholine esterase，ACE）对非天然酯的水解表现出很高的立体选择性，但是这种酶是从电鳗中分离纯化制备的，价格昂贵，限制了它的使用。胆固醇酯酶（cholesterol esterase）只能对结构较大的甾醇酯化合物有催化作用。完整微生物细胞能选择性地催化酯水解，但实现该反应的条件复杂。一种来自微生物的羧酸酯酶NP（carboxy l-esterase NP）已可用基因工程法表达制备，该酶能催化某些特殊结构酯高选择性水解。

许多蛋白酶同样能选择性水解羧酸酯，使用最多的是α-胰凝乳蛋白酶（α-chymotrypsin）、枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）。使用相对较少的有胰蛋白酶（trypsin）、胃蛋白酶（pepsin）、木瓜蛋白酶（papain）和青霉素酰化酶（penicillin acylase）。大多数蛋白酶对一些非天然羧酸酯具有很高的对映体选择性。