重原子的核在其吸收曲线的一定范围吸收X射线。如果射线波长和重原子的吸收边缘重合，就会产生吸收，并可在实验中观察到衍射和相位滞后。由于这种相位滞后或非常规的散射，干涉图象就不仅取决于原子间的距离，还取决于它们在空间的相对位置，因而可能测定重原子分子的绝对构型。

手性分子绝对构型的第一次实验测定在1951年实现。锆的Ka线射线首次应用于天然酒石酸钠铷的绝对构型的测定。结果得出（+）-酒石酸钠铷的绝对构型，并将这个方法称为Bijvoet法。以酒石酸钠铷的绝对构型的测定为起点，通过以物理-化学比较为基础的关联或化学反应的转化，其他化合物的绝对构型可以逐步的测定。

现在用自动化的X射线衍射仪可以测定氧原子和氮原子等很弱的反常衍射，而得出各组成原子在非对称构型的排列。

1.单色光旋光性的测定绝对构型

手性分子具有光学活性的原因，至今还不能认为是很清楚的。但由于测定旋光性的实验资料的积累，化学家们就总结出了一些经验性的结构旋光性的关系规则。例如，Van't Hoff的旋光性叠加规则、Freudenberg的衍生物旋光性位移规则，以及Brewster的不对称碳原子的构型和旋光方向的关系规则、非对称构象与旋光方向和数值的关系规则等。尽管这些规则有时不是很精确，但也可以使人们有可能从与结构有关的化合物旋光性的测定和对比中，推导出未知的不对称中心的构型，为人们提供了一些方便。

20世纪50年代后期，Brewster提出了一个计算物质旋光性的符号及其大小的方法，该方法以物质的构型和构象为基础，用来观察物质的旋光性。该方法对于那些不对称中心原子无环内结构以及分子的各构象可自由运动的化合物是有价值的。若取代基之间存在相互作用，并且使分子的构象存在固定的因素，情况就不一样了。如α-氨基酸及α-羟基酸分子中存在着由氢键所固定的因素，实际上α-羟基丙酸和α-氨基丙酸两者提供的构型旋光性和固定构象所测定的旋光性其符号正好相反。α-羟基丙酸的旋光性应当右旋的，然而，该构型按其构象的贡献是左旋的，因为实际得旋光度[α]D=-0.3。

2.旋光光谱和圆二色性光谱

（1）旋光光谱（optical rotatory dispcrsion，ORD）。如上所述，旋光性物质的比旋光度值与测定所用的波长有关。通常在旋光仪上使用的钠光源（钠蒸气灯）其波长为589nm，有时在文献中也有采用汞光源的，其波长为546nm，然而近年来文献中已经广泛使用了旋光光谱仪，现简述如下。(www.daowen.com)

旋光光谱仪早期译作旋光散射曲线，采用广泛的波长范围来进行研究。一个旋光性物质在旋光光谱仪中，采用不同的波长进行测量可获得不同的旋光度值，绘制成曲线即称旋光光谱。

旋光光谱曲线清楚地表明在钠光源下可能有相同或相似的两种旋光性物质，但它们的旋光度随波长的变化所获得的旋光光谱曲线却可完全不同，旋光光谱的特征是由旋光性物质的构型及构象所决定的，也与发色基团和手性中心的相对位置有关。在很多情况下，旋光光谱的曲线图形现状还与温度和溶剂有关。所有这些特点才使得旋光仪成为研究有机化合物立体结构的重要方法之一。在一个有机化合物中，可能存在一个光学活性的基团，但该物质可能反映不出旋光性（或者很小，普通旋光仪测不出），然而，使用旋光光谱仪则可以方便地研究这些物质。

旋光光谱可以用简单的曲线来表示，即简单的上升曲线或下降曲线，它们可以是正值，也可以是负值，这要由曲线对横坐标的斜率来决定（但这不是旋光符号）。由于波长的缩短，曲线呈上升或下降的变化。有时，在研究旋光光谱曲线图的特征时会遇到著名的Cotton效应，具有Cotton效应的旋光光谱曲线具有最大点（最高点）和最小点（最低点），分别称为峰和谷。如果旋光光谱曲线中峰的波长比谷的波长长，那么该曲线称为正Cotton效应。如果情况相反，即旋光光谱中峰的波长比谷的波长短，那么该曲线称为负Cotton效应。在这里，旋光符号或者旋光方向并不重要，在研究Cotton效应时就必须注意Cotton效应中振幅（amplitude）、带宽大小（width）等特征。

（2）圆二色性光谱（circular dichroism，CD）。旋光性物质对左右圆偏振光吸收系数之差值采用式（2-3）计算：

用Δε对波长作图，即可得圆二色性光谱图。像旋光光谱图曲线一样，如果旋光性物质的分子中没有特殊的发色基团，则该曲线谱图为一个非常的光滑曲线，因为Δε的值对波长作图变化小，近似于水平线。如果在旋光光谱曲线中出现Cotton效应，那么在圆二色光谱中也将相应地出现起伏。一般来说，圆二色光谱曲线和旋光光谱曲线所提供的信息具有相似性，然而圆二色光谱曲线对于解释理论和计算更方便些。

旋光光谱和圆二色光谱是两个关系比较密切的研究旋光性物质的方法，是近年来研究立体化学行之有效的方法，可以区别对映体、非对映体、旋光活性等。对旋光光谱曲线和圆二色光谱曲线的研究还发现，它们对分子的立体结构变化特别敏感。例如，任何酮的结构其紫外光谱具有特殊性质，即所有羰基发色基团吸收带都在300nm附近出现，而旋光性酮的旋光光谱曲线的特征则取决于发色基团（羰基）的环境，整个分子的结构首先由发色基团与手性中心之间的距离所决定。