实验目的

1.了解Y染色体SNP标记在人类群体遗传研究中的作用。

2.掌握人类基因组DNA的提取方法。

3.了解Y-SNP的检测方法。

4.学习利用SNP遗传标记进行群体遗传分析的方法。

实验原理

人类基因组中存在大量的非编码序列，其突变绝大多数是中性的。人类基因组以惊人的稳定速率积累着这些突变。比较、研究相应DNA区段的变异速率和序列间差异，能为人类的起源、进化、人群迁徙提供可靠的遗传学证据。起初，人们把注意力集中在母系遗传的线粒体DNA，之后又开始注意到可追溯父系历史的Y染色体。人类Y染色体属于近端部着丝粒染色体，其两端各有一小部分拟常染色区（pseudoautosomal region），可在减数分裂过程中与X染色体的相应区段进行交换重组，其余大部分为Y-特异性区，是非重组区；同时Y染色体的单倍型保持完整，不易受重组和回复突变的影响，突变率低，遗传稳定。由于Y染色体这些特性，使它成为研究群体遗传多样性的绝好标记，也是对线粒体DNA的很好补充。

人类DNA遗传标记的发展主要经历了限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、基于PCR技术的可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeats，VNTR）多态性和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）三个阶段。近年来，作为第三代遗传标记的双等位基因标记系统（biallelic markers）——包括单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）和小片段插入/缺失（insertion/deletions，indels），因其具有分布广泛、遗传稳定、突变率低及易于分析等优点而逐渐成为研究热点。单核苷酸多态性（SNPs）是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性,在人群中的发生频率大于1‰。SNPs有单碱基的转换、颠换、插入和缺失等形式。SNPs基因组每个核苷酸的突变率约为10-9，即在现有人口的基础上，每个核苷酸在任何一代人中的6×109个个体中会发生一次突变，这样就会形成许多双等位基因标记物，1 000 bp中就存在一个这样的SNP位点。Y染色体的双等位基因位点的突变率低，不易受重组和回复突变的影响，由双等位基因构成的单体群保持完整，因而是进化事件的忠实记录者，可以鉴定稳定的谱系关系。但单个SNP位点通常只有2个等位基因，其多态性程度很低，故只有同步分析大量SNP位点，提高其鉴别能力，才具有实用价值。

本实验应用片段长度差异等位基因特异性PCR（fragment lengthdiscrepant allele specific PCR，FLDAS-PCR）技术对某一群体的4个Y染色体双等位基因标记进行分型研究，检测Y染色体的多态性。

实验用品

1.材料

某一群体或区域人群的冰冻血样。

2.试剂

（1）DNA提取试剂

①PBS缓冲液：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，加超纯水定容至1 000mL，调pH至7.4，高压灭菌，4℃保存。

②DNA抽提液：Tris（10mmol/L）0.6057g，EDTA（0.1mol/L）18.612g，SDS（0.5%）2.5g，加超纯水定容至500mL，调pH至8.0，高压灭菌，4℃保存。使用前放至37℃水浴中，使之完全溶解。

③20mg/mL蛋白酶K溶液，-20℃保存。

④Tris饱和苯酚、氯仿、70%乙醇。

⑤无水乙醇：用前-20℃预冷。

⑥TE缓冲液：Tris（10mmol/L）0.6057g，EDTA（1mmol/L）0.1861g，加超纯水定容至500mL，调pH至8.0，高压灭菌，4℃保存。

（2）PCR及产物纯化试剂

dNTPs、KCl、Tris-HCl、MgCl2、引物、Taq DNA聚合酶、UNIQ-5柱离心式反应体系DNA纯化试剂盒（上海Sangon）。

3.器具

制冰机、冰箱、冷冻低温超速离心机、分光光度计、微量移液器、恒温水浴箱、酸度计、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、无菌枪头、无菌离心管（2.0mL，0.2mL）、离心管盒、枪头盒等。

实验操作程序

1.酚-氯仿抽提DNA

（1）冰冻的血样在室温水浴中融化；将1mL全血转入一个无菌的2mL离心管中。

（2）加入等体积（1mL）的PBS缓冲液，温和摇动15min；室温3 500r/min离心10min。

（3）用移液器弃上清，重复步骤（2）至上清液透明、沉淀无色。

（4）离心管中加DNA提取液1mL，温和摇动使细胞沉淀悬浮；37℃水浴1h。

（5）加入蛋白酶K 3μL（终浓度为60μg/mL），混匀。

（6）在恒温水浴中55℃温育过夜（16h左右），至细胞沉淀物被完全消化，溶液澄清。

（7）反应液冷却至室温，加入1倍体积（1mL）的Tris饱和酚，放置冰上温和摇动20min；4℃，12 000r/min离心10min。

（8）将上层水相用移液器移到另一无菌离心管中；加入0.5倍体积（0.5mL）的饱和酚和0.5倍体积（0.5mL）的氯仿，放置冰上温和摇动20min；4℃，12 000r/min离心10min。

（9）将上层水相用移液器移到另一无菌离心管中；加入1倍体积（1mL）的氯仿，放置冰上温和摇动20min；4℃，12 000r/min离心10min。(www.daowen.com)

（10）将上层水相转移到另一无菌离心管中；加入2倍体积的预冷无水乙醇（-20℃），轻轻颠倒多次至DNA析出，然后-20℃放置30min；用玻璃钩将DNA团钩出转入一新的无菌离心管中，或4℃，12 000r/min离心10min，弃去乙醇。

（11）加入70%乙醇1mL，温和摇动10min；4℃，12 000r/min离心10min，弃乙醇，重复漂洗一次。

（12）真空干燥或室温下使乙醇挥发干净。

（13）根据DNA的量，加入超纯水100～300μL，4℃保存至DNA完全溶解，分光光度计测定浓度后，-80℃保存。

2.位点选择及引物设计

本实验选择4个Y染色体双等位基因标记（M9、M89、M119、M122）的等位基因频率及其构成的单体群遗传多态性进行研究。每套引物均由两条相差5bp的特异性引物和一条反向公用引物组成，其中两条特异性引物分别在其3′端第3或第4位引入不同碱基错配，部分引物在较长等位基因的5′端第6、7位碱基引入错配，以提高特异性（见表25-1）。

表25-1　4个Y染色体双等位基因标记的引物序列及PCR扩增条件

3.PCR扩增及产物检测

PCR反应体系10μL，内含100 pmol/LdNTPs，50mmol/LKCl，10mmol/LTris-HCl（pH8.3），1.5mmol/LMgCl2，0.5 U Taq DNA聚合酶，5～20 ng 模板DNA，优化后的各引物浓度见表25-1。PCR 扩增循环参数为：95℃2min，然后94℃30 s，最佳退火温度见表25-1，72℃35 s，共32个循环，再72℃延伸5min。扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶（T=6%，C=5%）电泳后，银染显带。

4.DNA纯化及测序

不同等位基因的PCR产物用UNIQ-5柱离心式反应体系DNA纯化试剂盒（上海Sangon）纯化后测序。操作程序见试剂盒说明书。

5.统计分析

用直接计数法计算双等位基因标记的等位基因和单体群频率。基因多样性（genediversity，GD）和单体群多样性（haplogroupdiversity，HD）按公式h=n（1-∑Xi2）/（n-1）计算，其中n为样本数，X为等位基因频率或单体群频率。

预期实验结果与分析

1.4个双等位基因标记理论上均能检出大小相差2～5bp的2个不同等位基因，每个男性个体均为单一谱带，女性样品没有扩增产物。4个标记的等位基因频率及其构成的单体群频率分布见表25-2和表25-3。

表25-2　4个Y染色体双等位基因标记的基因频率分布

表25-3　4个Y染色体双等位基因标记构成的单体群及其频率

2.计算基因多样性（genediversity，GD）和单体群多样性（haplogroupdiversity，HD）。

要点及注意事项

1.DNA提取过程中转移上清液时，注意避免将下层混浊液一并吸出。

2.人全血DNA提取还可选用Chelex-100法。

3.目前发现的人Y染色体SNP位点超过几十个，可根据具体实验条件增减和选择标记的类型和数量。

作业与思考题

1.查阅资料，了解第三代分子标记SNPs在遗传分析方面的应用。

2.根据实验结果，计算实验群体的基因多样性（GD）和单体群多样性（HD）。

参考文献

1.乔守怡.遗传学分析实验教程［M］.北京：高等教育出版社，2008.

2.薛雅丽等.Y-DNA多态与人类进化［J］.国外医学遗传学分册，2002，25（3）:142-145.

3.黄代新等.武汉汉族群体23个Y染色体双等位基因标记遗传多态性研究［J］.遗传，2006，28（7）：791-798.

（孙英莉）