实验目的

1.掌握人类体细胞性染色质玻片标本的制作方法。

2.观察识别X染色质和Y染色质的形态特征及其所在部位，鉴定个体性别。

3.学习人类体细胞核内X染色体和性染色质数目之间存在的关系。

实验原理

人类体细胞性染色质是在间期细胞核中由性染色体演变而来的一种结构小体，这种小体包括X染色质（X小体）和Y染色质（Y小体）两种。

（一）X染色质

1949年，M.L.Barr和Bertram等人首次在雌性猫的神经细胞间期核中发现一种深染色的浓缩小体，这种小体既与核仁、核膜紧贴而又分离，在雄性猫中却没有。进一步的研究表明，这种两性异型现象普遍存在于偶蹄类、蝙蝠类、食肉类和灵长类等雌性哺乳动物的多种组织细胞中。后来在其他雌性哺乳动物细胞和人类女性体细胞中也发现有类似的结构。Barr把这种小体称为核仁随体，他推断是由性染色体的异染色质衍化而来的。由于这种染色质小体是雌性细胞的特征，雄性细胞中没有，所以人们称之为巴氏（Barr）小体或X小体，也称X染色质。后人研究证实，X染色质就是两个X染色体的其中之一在间期时发生异固缩（细胞分裂周期中与大部分染色质不同步的螺旋化现象）的结果，属于延迟复制的染色体，通常处于失活状态。

正常女性体细胞，如口腔黏膜细胞、皮肤结缔组织、宫颈上皮细胞、羊水脱落细胞、毛根细胞等细胞的间期核中都存在X染色质。用改良苯酚品红染液或硫堇紫染液染色后，便可观察到结构致密的深染小体，轮廓清楚，直径约1μm，常位于核膜内侧缘，呈圆形、卵圆形、扁平或三角形等多种形态。女性体细胞核中X染色质的出现率为30%～60%，男性中偶见不典型者。正常女性有两条X染色体，因此只有一个X染色质；正常男性只有一条X染色体，一般情况没有X染色质（图22-1）。

1961年，英国学者M.F.Lyon通过对小鼠X连锁毛色基因的遗传学观察研究，提出了X染色体失活的假说，即Lyon假说，对这些现象进行了解释。其要点如下：

图22-1　人口腔细胞X染色质

（转引自Russell，1992，略改动）

（1）正常雌性哺乳动物体细胞内，两条X染色体中仅有一条是有活性的，另一条在遗传性状表达上是失活的。失活的染色体在间期细胞核中螺旋化而异固缩为X染色质。

（2）X染色体的失活是随机的。失活的X染色体可能来自父方，也可能来自母方。

（3）X染色体失活发生在胚胎发育的早期，一旦某一条X染色体失活，那么在相继的细胞世代（子代）中，也总是同一条X染色体处于失活状态。

有很多的实验证据都支持Lyon假说。Morishima等（1962）利用放射性标记技术，证实处于失活状态的性染色体与其他异染色质一样，在DNA复制时总落后于其他常染色质。通过细胞化学研究，X染色质表现出福尔根阳性反应和甲基绿派洛宁深染，证实有DNA的存在。如人类的一种无汗性外胚层发育不良（anhidrotic ectodermaldysplasia）病症，是一种X连锁异常，正是在胚胎发育期一条X染色体随机失活所致。

由于雌性细胞中有两条X染色体，而雄性细胞中只有一条X染色体，为了保证X染色体上基因表达产物的量在雌雄两性中处于相同水平，所以雌性细胞中有一条X染色体失去活性，这是一种剂量补偿效应。这样使得雌雄两性细胞中都只有一条X染色体保持转录活性，是维持雌雄两性生物基因表达一致所特有的遗传效应。

需要说明的是，即使失活的X染色体，其基因并非全部失去活性，有部分基因仍具有一定的活性，因此X染色体数目异常的个体，不仅在表型上有别于正常个体，而且出现多种异常的临床症状。通过巴氏小体检测可确定胎儿性别和查处性染色体异常的患者。如外貌为男性的克氏（Klinefelter’s）综合征患者，却有一个巴氏小体，可判断该患者的核型是47，XXY；外貌为女性的特纳氏（Turner’s）综合征患者却无巴氏小体，可判断其核型是45，XO。其他性染色体异常，如XXX、XXXY，细胞核中就会有两个巴氏小体。极其罕见的拥有4条X染色体的不正常女性，其细胞核中则有3个巴氏小体，而且X染色体越多，表型的异常越严重。由此可见，某个体的间期细胞核内X染色质的数目是该个体X染色体的数目减一。

通过对X染色质的研究，有助于揭示X连锁基因的调控机理和性染色体的进化过程，对于医学遗传学的研究、临床以及法医诊断都具有一定的现实意义。

（二）Y染色质

1970年，Pearson等人以男性的口腔上皮细胞和成纤维细胞为材料，用荧光染料进行染色，发现在细胞核的中部或近边缘处，有一直径约为0.25μm的荧光小体，呈圆形或椭圆形。这种小体长期存在于间期细胞核内，认为是雄性哺乳动物细胞中Y染色体长臂远端的异染色质区所形成，因此称之为Y染色质或Y小体。Y染色质在男性中出现的频率一般为20%～50%，但由于个体的差异，出现的频率可能有较大不同。在男性的口腔上皮细胞、淋巴细胞以及精液中都可检测出Y染色质，正常男性细胞中可见一个，正常女性细胞中则不出现，但偶有例外。实践中进行Y染色质的检测，对于性别发育的鉴定和Y染色体异常的诊断都具有一定的实际意义。

实验用品

1.材料

正常男、女性的口腔黏膜细胞和毛根鞘细胞。

2.试剂

（1）蒸馏水。

（2）0.4%生理盐水。

（3）95%乙醇。

（4）75%乙醇。

（5）45%醋酸溶液。

（6）5mol/L盐酸。

（7）固定液：甲醇∶冰醋酸=3∶1，现配现用。

（8）固定液：95%乙醇∶乙醚=1∶1，现配现用。

（9）改良苯酚（石炭酸）品红染液。

（10）Macllvaine’s缓冲液（pH6.0）。

（11）硫堇紫染液。

（12）0.2%甲苯胺蓝染液。

（13）0.5%盐酸喹吖因染液。

（14）0.05%芥子喹吖因染液。

（15）香柏油。

3.器具

普通显微镜、荧光显微镜、离心机、电子天平、冰箱、加样枪、枪头盒、尖嘴镊子、灭菌牙签、离心管盒、1.5mL离心管、吸水纸、擦镜纸、称量纸、纸杯、载玻片、盖玻片、试剂瓶、滴瓶（白色、棕色）、染色缸、吸管、烧杯、量筒、玻棒等。

实验操作程序

（一）X染色质标本的制备与观察

1.口腔黏膜细胞

（1）取材：让女性受检者用水漱口数次，再用无菌牙签刮取口腔两侧颊部上皮黏膜细胞，弃去第一次的刮取物（去掉上皮死细胞和细菌等）后，在原位刮取2～3次，将刮取物置于盛有0.5mL0.4%生理盐水的离心管内。用同样方法刮取男性口腔上皮细胞作为对照。

（2）固定：置于离心管中的材料（口腔上皮黏膜细胞），先在2 000r/min离心20min，弃去上清液，加入1mL固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1），混匀后静置30min，再于1 000r/min离心15min后弃上清，加入1mL固定液，充分混匀后制成细胞悬液。

（3）酸解：新制成的细胞悬液，用吸管滴一滴于预冷的洁净载玻片上，晾干后，于样品处滴加1～2滴5mol/L盐酸，静置酸解10min，然后用缓慢水流冲洗几遍，晾干。

（4）染色、制片：待玻片干燥后，于样品处滴加1～2滴改良苯酚品红染液，染色3～5min（勿使干燥），覆盖洁净盖玻片，垫上吸水纸，用拇指轻压即成为临时制片。(www.daowen.com)

（5）镜检：先低倍镜下找到上皮细胞，再高倍镜或油镜下观察。选择80～100个分散良好、细胞核较大、核膜完整、染色适度的细胞，观察X染色质的形态特征，并统计出现频率。

2.毛根鞘细胞

（1）取材：拔取女性带有毛根鞘（发根）的头发，长2～3cm，置于洁净的载玻片上。同样取男性带有毛根鞘的头发作为对照。

（2）酸解：在发根部位滴加1～2滴45%醋酸（或5mol/L盐酸）溶液，静置酸解5min，可使毛根鞘细胞充分软化，用吸水纸吸去多余的醋酸（或盐酸）溶液，或用蒸馏水冲洗。

（3）转移：用尖嘴镊子将软化的根部组织剥于另一洁净载玻片，弃去毛干，用镊子尖将剥下的组织均匀分散，空气干燥。

一根发根的毛根鞘细胞可以转移到3～4张载玻片，既可以充分利用实验材料，又可以观察到单层分布的细胞。

（4）染色：待玻片干燥后，滴加1～2滴硫堇紫染液，染色10～20min。

（5）漂洗：将玻片转入75%乙醇中，漂洗约30s后，取出晾干。

（6）镜检：同口腔黏膜细胞镜检方法。

染色的方法除用硫堇紫染液外，还可用改良苯酚品红染色3～5min，盖上盖玻片，垫上吸水纸后压片，或用0.2%甲苯胺蓝染色2～3min，蒸馏水漂洗，空气干燥后，即可镜检。

（二）Y染色质标本的制备与观察

1.取材涂片

让男性受检者用水漱口数次，再用无菌牙签刮取口腔两侧颊部上皮黏膜细胞，弃去第一次的刮取物（去掉上皮死细胞和细菌等）后，在原位刮取2～3次，分别涂抹于洁净的载玻片上，范围为1～2张盖玻片大小，空气干燥。用同样方法刮取女性口腔上皮细胞作为对照。

2.固定

待涂片干燥后置于固定液（乙醇∶乙醚=1∶1）中，固定20min～12h，然后转入95%乙醇中30min，取出空气干燥。

3.染色

将处理好的涂片浸入Macllvaine’s缓冲液（pH6.0）中5min，然后投入0.5%盐酸喹吖因染液（或0.05%芥子喹吖因染液）中，染色10min。

4.漂洗

取出已染色的涂片，先用缓慢流水冲洗1min，再在蒸馏水中漂洗一下，除去多余的染色颗粒。

5.盖片

在样品上滴加1～2滴Macllvaine’s缓冲液，覆盖洁净盖玻片，垫上吸水纸，用拇指轻压即成为临时制片。

6.镜检

将制片置于荧光显微镜下，先用低倍镜观察，后用油镜观察，选择80～100个分散良好、核膜完整清晰、染色适度的细胞（整个细胞发荧光亮者不计入），观察Y染色质的形态特征，统计出现频率。

预期实验结果与分析

1.X染色质制片观察

显微镜下观察可见，X染色质通常位于细胞核的核膜内侧边缘，呈现为结构致密的浓染小体，染色比核质深，轮廓清晰，直径约1μm，有圆形、卵形、微凸形、三角形等多种形态。X染色质为女性细胞中特有的染色体结构，是一条X染色体呈异固缩状态而形成。正常女性间期核中可观察到一个X染色质，出现频率从30%至60%不等，正常男性细胞中无X染色质（如图22-1），或在个别细胞中出现不典型的X染色质（约2%），各实验室得到的统计结果可能有所不同。

2.Y染色质制片观察

一般应将制备好的片子静置于暗处（或保持室内光线较暗），在12～17h之内镜检为宜，因为12h之前出现Y染色质的细胞很少，而且Y染色质的荧光不够明亮，17h之后制片开始褪色。具体时间可根据实验安排，但制片应静置于暗处至少30min，然后在荧光显微镜下观察。

在低倍镜下观察，可见细胞核被染成黄色。在油镜下观察，在核内中部或近核膜边缘处，出现一个较强的荧光点，小而亮、呈黄色，直径约0.25μm，圆形或椭圆形，即为Y染色质。正常男性口腔黏膜细胞中Y染色质出现的频率一般为20%～50%，正常女性中不出现，却偶有例外。

要点及注意事项

1.制片取材时，刮取口腔上皮细胞用的牙签必须提前灭菌，可用牙签的钝端或削成扁平状的一端刮取，并注意安全。

2.涂片要晾干后再染色，这样细胞能牢固地粘到载玻片上，在染色时不会脱落。

3.染色时间不宜太长，否则细胞核染色较深，反差较小，影响性染色质的观察。

4.固定液要新鲜配制，最好现配现用。

5.荧光染液最好现配现用，避光保存。用盐酸喹吖因染色后的制片也要避光存放，荧光显微镜观察时保持室内暗光。

6.喹吖因等荧光染料是DNA的嵌合剂，属于致畸变类试剂，使用中要注意安全。

作业与思考题

1.根据观察结果，图示性染色质的形态特征和在细胞中的分布状况。

2.简述X染色质和Y染色质形成的机制。

3.检测X染色质和Y染色质有何实际意义？

4.观察一位女性或男性的80～100个口腔黏膜细胞，统计性染色质的出现频率，结果填入表22-1。

表22-1　性染色质出现频率统计

参考文献

1.王金发，戚康标，何炎明.遗传学实验教程［M］.北京：高等教育出版社，2008.

2.张根发.遗传学实验［M］.北京：北京师范大学出版社，2010.

3.卢龙斗，常重杰.遗传学实验技术［M］.北京：科学出版社，2007.

（牛炳韬）