实验目的

1.掌握CRISPR/Cas9技术原理及关键操作流程。

2.了解基因远端元件（增强子）对靶基因表达的调节。

实验原理

基因编辑就是通过对细胞基因组中目的基因的一段核苷酸序列甚至是单个碱基进行切除、替换、增加或者插入外源的DNA序列，使之产生可遗传的改变。这种技术可以精确定位到基因组的某一特定位点并在该位点上剪切DNA，在基因组修复的过程中引入突变，实现基因的定点突变。这个过程不仅模拟了基因的自然突变，而且实现了对原有基因的修改和编辑。目前常用的基因编辑技术主要有三种：

（1）人工核酸酶介导的锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFN）技术；

（2）转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator- like effector nucleases，TALEN）技术；

（3）RNA引导的CRISPR- Cas 核酸酶技术（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/Cas-based RNA-guided DNAendonucleases，CRISPR/Cas）。

现代基因编辑技术的基本原理是相同的，即借助特异性DNA的双链断裂，通过非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HDR）两条途径对基因组进行编辑。

CRISPR/Cas9是很多细菌和大部分古细菌的天然免疫系统，通过对入侵病毒的核酸进行特异性识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。CRISPR系统在1987年被发现，2012年6月，Doudna/Charpentier联合课题组在《科学》杂志上发表CRISPR/Cas9作为基因编辑技术的第一篇研究论文，首次在体外证明CRISPR/Cas9技术可以切割任何的DNA链；2013年成功利用对细胞系进行基因删除和定点突变。本实验所用的CRISPR/Cas9系统由Cas9核酸内切酶和CRISRP两部分构成。CRISPR通常由短的高度保守的重复序列（PAM序列，5′-NGG-3′）组成，重复序列的长度一般为21～48 bp，重复序列之间被26～72bp的间隔序列（Spancer）隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列与靶基因进行识别的。Cas（CRISPR associated）存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在gRNA引导下对靶位点进行切割，如图21-1所示。在人类基因组中，平均每8bp就可能出现一个PAM序列，利用这样的特点，可以通过人工构建相邻的两个sgRNA，利用Cas9蛋白对真核细胞基因组进行切割进而释放中间短片段，从而达到目标片段删除的效果。

图21-1　CRISPR/Cas9对靶位点的识别切割示意图

（引自F Ann Ran等，2013）

C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）主要由肝脏表达和分泌，是人类典型的急性期蛋白，在炎症反应、先天免疫和后天免疫中发挥重要的调节作用。Hep3B是一种人源肝癌细胞系，可以表达分泌CRP并在因子刺激后具有明显的急性期反应。在研究中发现，在CRP基因上游40kb处有一段远端序列调控CRP急性期表达，为了进一步证明该段序列对CRP急性期的调控作用，我们利用CRISPR/Cas9对该段序列进行原位敲除，通过荧光定量（RT-qPCR）检测删除前后CRP急性期的改变。由于该段增强子仅对CRP的急性期表达起调节作用，故理论上是否删除成功在静息态表型没有差异，而在炎症因子诱导下，删除元件的细胞系CRP表达将被显著压制。但在实际操作中通过慢病毒载体，构建稳定表达Cas9蛋白和sgRNA的真核细胞系，能达到的删除效率不足10%，所以往往我们需要进一步的单克隆筛选，通过基因组PCR技术检测删除效果，最终获得我们需要的删除成功亚克隆系。

实验用品

1.材料

293T细胞、Hep3B细胞、plasmid psPAX2（12260）、plasmid pMD2.G（12259）、plasmid pKLV-U6gRNA（BbsI）- PGKpuro2ABFP（50946）、plasmid pLentiCas9-BFP（78545）。

2.试剂和培养基

（1）LB培养基：1%NaCl，0.5%酵母提取物（Yeast Extract），1%蛋白胨（Tryptone），固体培养基需加入1.5%琼脂粉（Agar）。

（2）DMEM培养基（sigma公司）。

（3）EMEM培养基（sigma公司）。

（4）MEM培养基（Gibico公司）。

（5）胎牛血清（Fetal Bovine Serum，BI）。

（6）1 000×双抗青链霉素（sigma公司）。

（7）转染试剂Lipofectamine®2000 Reagent（sigma公司）。

（8）质粒纯化试剂盒E.Z.N.A.@Endo-Free Plasmid DNAMidi Kit（上海索宝生物科技有限公司）。

（9）5mg/mL嘌呤霉素（puromycin）储存液。

（10）聚凝胺。

（11）细胞裂解液：100mmol/LTris-HCl，1%Triton-100，100μg/mL蛋白酶K。

（12）0.025%胰蛋白酶。

（13）PBS溶液：8g NaCl，0.2g KCl，1.42g无水Na2HPO4，0.27g KH2PO4，用去离子水定容至1 000mL。

（14）无菌水。

（15）PCR反应试剂盒（EXTaq，takara）。

（16）琼脂糖。

（17）50×TAE Buffer。

（18）Gel/PCR Extaction Kit（qiagen公司）。

（19）5×Loading Buffer。

（20）5mg/mL灭瘟素（Blasticidin）储存液。

（21）细胞因子IL6和IL1b（BD）。

（22）DNA/RNA提取试剂盒。

（23）SYBR。

（24）氨苄青霉素（Amp）。

3.器具

超净工作台、细胞安全柜、恒温振荡器、电子天平、离心机、PCR管、PCR仪、电泳仪、电泳槽、血球计数板、盖玻片、细胞瓶、酒精灯、窄口试剂瓶、塞子、镊子、移液器、5mL移液器枪头、2～1 000μL移液器枪头、1.5mL离心管、4mL离心管、10mL离心管、涂布棒等。

实验操作程序

（一）Hep3B Cas9稳转细胞系和Hep3B Cas9-2gRNA稳转细胞系的构建

1.sgRNA载体构建

（1）sgRNA设计合成

目的敲除序列：

GTTGACCTCAGGAAGGATTTGCGACAGTGCTTGGCAATCACGTGACACACCAGCTATT CCTTCCCATCATTAACTTGGCATTGACTGGACAAGCAACAGGGCACCATTCCAGGTGTGTG TTGAAATTCTCTGGTGTCCTTTGAAATCCTAAG

利用　　　http://www.crisprscan.org/?page=sequence 设计sgRNA，得到靶向该序列上下游的两条gRNA如下（预计删节片段大小约0.5 Kb）：

gRNA0.5k-s1：GGGAGCTGTAGAGTTTGGCG

gRNA0.5k-s2：GGGGCCTCCAGGGTGAGTTA

使用骨架载体pKLV-U6gRNA（BbsI）-PGKpuro2ABFP，已含有一个U6 启动子和gRNA插入位置，可直接合成一段序列含第一个完整gRNA的结构和一个经改造的启动子（mU6）以及第二个gRNA的识别序列，交由公司合成，具体如下：

GAAGACCCCACCGGGAGCTGTAGAGTTTGGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA GTTAAAATAAGGCT0AGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAA2AATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCTCTAGAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATAATATTTCCTAGTAACTATAGAGGCTTAATGTGCGATAAAAGACAGATAATCTGTTCTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGCTTGGATTTCTATAAGAGATACAAATACTAAATTATTATTTTAAAAAACAGCACAAAAGGAAACTTACCGTAACTTGAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTTTATATATGCATGCGAGAAAAGCCTTGTTTGAAACACCGGGGCCTCCAGGGTGAGTTAGTTTTAGGGTCTTC

（2）酶切骨架载体pKLV-U6gRNA（BbsI）-PGKpuro2ABFP和第二步中合成的gRNA序列，切胶回收线状质粒（参见试剂盒说明书），在连接酶作用下连接目的片段和载体（参见试剂说明书）。

（3）转化并筛选合适菌株

取一支Stable 3感受态，置于冰上10min使感受态解冻；加入连接产物，轻轻混匀，在冰上放置至少30min，42℃热激90s，再冰上放置3min，加入1mL无抗LB培养基，于37℃、220r/min振荡培养1h，然后1 000r/min离心菌液5min，弃去800μL上清，用剩下的培养基将沉淀吹匀，均匀的滴到LB平板上，并用涂布棒涂匀。

（4）选取4～5个克隆用2mL加入Amp的LB培养基振荡12h，并取1mL菌液送公司测序，检测插入目标gRNA序列是否合适。(www.daowen.com)

（5）测序合格后提取质粒（使用E.Z.N.A.@Endo-Free Plasmid DNAMidi Kit提取，按说明书进行）用于病毒包装。

2.病毒包装

（1）提取psPAX2，pMD2.G，pLentiCas9-BFP和上述构建的sgRNA载体。

（2）培养293T细胞。

（3）将细胞从细胞瓶中消化下来，计数，将细胞浓度稀释到0.5×105个/mL，以每个孔2mL加入6孔板，尽量使细胞均匀的铺在板孔底部。

（4）转染：使用Lipofectamine®2 000 Reagent共转染包装病毒，步骤如下：

①用50μLMEM培养基（Gibico 公司）分别稀释pLentiCas9-BFP 和上述构建的sgRNA载体、psPAX2（1.5μg）和pMD2.G（0.5μg），用100μLMEM稀释Lip 2 000。

②将稀释的Lip 2 000和质粒混合并轻轻混匀，孵育15～30min。

③将孵育后的混合液加入到无抗培养的293T细胞液，并轻轻摇匀，置于37℃二氧化碳培养箱中培养6h，用新鲜的无抗培养基替换加入转染液的培养基，继续培养42h。

④将板孔中的上清吸取到4mL管中，3 000r/min离心10min，分装上清在，冻存于-80℃冰箱。

以上步骤尽量在安全柜中进行，且用过的器具和垃圾桶用消毒液严格消毒。

3.构建Hep3B cas9细胞系

（1）将3B细胞从细胞瓶中消化下来，计数，并以5×104个/孔的密度加入24孔板，过夜培养。

（2）用新鲜的无抗培养基替换板孔中的培养基。

（3）在安全柜中将冻存的病毒液融化后加入培养基，并加入7μL聚凝胺（去除细胞膜电势，增加病毒感染效率），然后置于37℃二氧化碳培养箱过夜培养。

（4）用新鲜的培养基替换过夜培养基，继续培养36h。

（5）将细胞从24孔板消化到6孔板，并按照5 ng/mL的浓度加入筛选的抗生素Blast，并培养48h。

（6）换新鲜培养基，继续培养，直到细胞长满孔，消化并传代至细胞瓶，冻存细胞。得到稳定表达Cas9蛋白的3B细胞系。

4.构建Hep3B Cas9-2gRNA细胞系

将步骤3中得到的细胞系按照步骤3感染包装了gRNA载体的病毒，并用5 ng/mL嘌呤霉素筛选，得到稳转细胞系。

（二）序列敲除细胞系的筛选

1.复苏上述稳定表达Cas9蛋白细胞系，等细胞密度达到70%左右后消化细胞并计数，将细胞密度稀释到100个/10mL培养基，轻轻吹匀；以每孔100μL将稀释后的细胞加入96孔板，并补加150μL新鲜培养基。

2.在5～7d后观察96孔板细胞生长状况。选取只有单个克隆的孔，并换新鲜培养基，其余孔弃置。继续培养5～7d后，消化细胞，取一半细胞提取DNA，剩余一半传代。

DNA提取方法如下：

（1）将一半细胞转入1.5mL离心管，以1 000r/min离心10min，弃上清（因为细胞量很少，可以少留部分上清，防止细胞被吸走）。

（2）配置裂解液：100μg/mL蛋白酶K，1%Triton-100，100mmol/LTris-HCl共10mL，每一个孔的细胞加入30μL消化液，补加5μLChelex-100。

（3）55℃孵育6h（注意：隔一段时间将盖子上的溶液甩一下，溶液挥发后DNA质量会下降），1 000r/min离心5min。

（4）取上清作为模板进行PCR验证，PCR反应体系条件参见Taq酶说明书。

验证引物序列为（没有删截产物大小1.76Kb，删除成功1.26Kb）：

引物1：TTTTGACTTTTCCCGTTCCCA

引物2：CAAGTTTCCTCCGGTTAGCAG

（5）琼脂糖凝胶电泳检测（具体方法参见实验十八）。

3.挑选有删截带的克隆，扩大培养，得到CRP远端调控元件稳定缺失的细胞系。

（三）元件删截对CRP急性期表达影响（选做）

将筛选到的稳定细胞系按照1×105个细胞/孔铺到96孔板中，培养24h后换液改为无血清EMEM培养基培养，一部分补加炎症因子（终浓度IL6 10 ng/mL+IL1b 1 ng/mL），对照组用PBS替代，继续培养24h后，提取RNA，反转录，荧光定量检测CRP表达情况（具体方案参见试剂说明书）。

目标CRP检测引物：

CRP-S：GGAGCAGGATTCCTTCGGT

CRP-R：CACTTCGCCTTGCACTTCAT

内参ACTB引物：

ACTB-S：CGTGGACATCCGCAAAGAC

ACTB-R：CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGA

预期实验结果与分析

本实验主要检测基因组元件的删除效果，由于技术本身的限制，整体删截效率很低，需要对细胞进行亚克隆筛选。通过预计删截区两端的引物进行检测，若细胞删除成功就可以检测到一条约1.2 kb的条带。实验中往往会检测到两条带：一条为没有释放片段的完整基因组；另一条为删除成功的条带。主要原因在于：如需释放目标片段，两端Cas9必须同时切割，一旦仅有一个位置发生切割，细胞就很快通过错配修复将断裂处重新连接，同时破坏原有的gRNA识别位点，不可再被切割，也就基本丧失片段释放的可能，可想而知这种效率是较低的。从而，可以看出作为二倍体的人源细胞系，想要获得纯合删除品系的概率是很低的。如图21-2所示的2个亚细胞克隆仅其中一条染色体删除成功。

虽然细胞系是元件删除的杂合体，但仍可以通过RT-qPCR检测该元件对靶基因的影响。从图21-2可知元件删除与否对正常条件（基线）下CRP mRNA的表达没有显著影响；但在炎症因子刺激下（刺激），CRP的表达被显著压制。

要点及注意事项

1.构建载体和摇菌时注意尽量在28℃进行，因为慢病毒载体不稳定，37℃摇菌容易导致删截。

2.包装慢病毒的时候一定要注意实验安全，做好防护措施。

3.用蛋白酶K孵育时注意经常观察，水分容易蒸发；水分全部挥发会导致DNA断裂或者降解，甚至导致PCR无条带显示。

4.细胞实验要严格无菌操作，避免污染。

图21-2　删除成功的两个细胞克隆以及因子刺激前后CRP mRNA的表达变化

作业与思考题

1.试述远端增强子与靶基因的作用关系。

2.举例说明如何实现基因组序列的原位删截。

参考文献

1.Ann R,Patrick D H,Jason W,et al.Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system［J］.Nature protocols，2013（10）：24.

2.Vidigal J A, Ventura A.Rapid and efficient one-stepgeneration of pairedgRNACRISPR-Cas9 libraries［J］.Nat Commun,2015，6：8083.

（王铭裕）