实验目的

1.掌握利用微卫星DNA研究DNA多态性的基本方法。

2.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法。

实验原理

简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）又称微卫星DNA，是一类由2～6个碱基组成的串联重复DNA序列。SSR标记技术是根据SSR两侧的保守序列设计引物进行PCR扩增，由于不同品种SSR基序的重复次数不同，导致PCR扩增条带差异性，即简单重复序列长度多态性（simple sequence length polymorphism,SSLP），SSLP很容易通过PCR快速扩增和高分辨率的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到。

SSR标记技术因具有多态性高、共显性遗传和对DNA质量要求不高等特点而被广泛应用于遗传多样性分析、基因定位、构建遗传连锁图谱、作物品种鉴别等各个领域。

亚洲栽培稻（Oryzasativa L.）可以分为两个主要的亚种，籼稻（Oryzasativa subsp.indica）和粳稻（Oryzasativa subsp.japonica）。这两个栽培亚种的种内表型变异非常显著，包括生长、发育和环境适应性。本实验用特定的两对SSR引物对这两个品种的SSR多态性进行分析，比较这两个品种之间的基因多态性。

实验用品

1.材料

籼稻（Oryzasativa subsp.indica）和粳稻（Oryzasativa subsp.japonica）。

2.试剂

（1）裂解液：100mmol/LTris-HCl（pH8.0），5mmol/LEDTA，500mmol/LNaCl，1.25%SDS，1%巯基乙醇，1%PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。

（2）1mol/LTris-HCl（pH8.0）：将121.1g的Tris碱溶解于约800mL蒸馏水中，再根据所要求的pH（25℃）加一定量的浓盐酸，调pH8.0，定容至1 000mL。

（3）苯酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1）。

（4）3mol/LNaAc（用冰醋酸调pH至5.2）。

（5）TE缓冲液：取1mL的1mol/LTris-HCl（pH8.0），与0.2mL的0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液混合后，用去离子水定容至100mL，灭菌，室温保存。

（6）异丙醇、氯仿、液氮、冰乙酸。

（7）5mg/mLRNase：用水溶解后煮沸10～15min，于-20℃贮存。

（8）10×TBE：Tris 108g，硼酸55g，EDTA 7.44g，ddH2O 定容至1 000mL。

（9）丙烯酰胺（Acr）母液：丙烯酰胺62.5g，N,N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）3.25g，尿素（Urea）125g，10×TBE 100mL，定容到1 000mL。

（10）聚丙烯酰胺凝胶电泳所需胶

①封底胶：琼脂糖1.0g，加入2×TBE至100mL中，在沸水浴或微波炉中加热，使之彻底溶化，配制成1%的琼脂糖溶液。

②变性胶（6%聚丙烯酰胺凝胶，120mL）：Urea 14.4g，ddH2O 67.5mL，10×TBE 12mL，40%Acr 18mL，混匀后溶解。

注胶前加入：10%过硫酸铵1.4mL，四甲基乙烯二胺（TEMED）60μL。

（11）40×染色贮备液：硝酸银4g，ddH2O定容至100mL，使用前取10mL稀释成400mL，使用浓度为0.1%。

（12）20×显影贮备液：氢氧化钠150g，四硼酸钠1.4g，ddH2O定容至500mL。

工作液：取显影贮备液20mL，甲醛1.6mL，ddH2O定容至400mL。

（13）琼脂糖凝胶电泳试剂

①0.5×TBE电极缓冲液：使用时稀释10×TBE缓冲液至0.5×TBE。

②10mg/mL溴化乙锭（EB）贮备液。

③6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。

（14）SSR引物：RM1812,RM8200。

3.器具

高速冷冻离心机、恒温培养箱、恒温振荡摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅、核酸蛋白分析仪、紫外分光光度计、制冰机、电泳仪、凝胶成像系统、紫外观测仪、冰箱、电子天平、液氮罐、混溶器、微波炉、移液枪、pH计、冰盒、移液枪、离心管（5mL）、研钵、制胶板、制胶槽、电泳槽、点样板、三角瓶等。

实验操作程序

1.水稻基因组DNA提取

（1）取籼稻和粳稻幼叶各0.5～1.0g置于预冷的研钵中，加液氮研磨成粉末状。

（2）再加入2mL裂解液继续研磨成匀浆，转入5mL离心管中,于60℃水浴中30min。

（3）12 000r/min离心5min，取上清液加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇，上下颠倒几次。

（4）12 000r/min离心5min，取上清液加等体积氯仿，上下颠倒几次。

（5）12 000r/min离心5min，取上清液加入1/9体积的3mol/LNaAc，混匀。

（6）加入等体积预冷异丙醇，上下颠倒几次。

（7）再12 000r/min离心6min，弃去上清液。(www.daowen.com)

（8）用75%乙醇浸洗沉淀两次，每次各20s，弃去乙醇。

（9）乙醇挥发后用50μLTE缓冲液溶解沉淀，-20℃保存备用。

2.琼脂糖凝胶电泳检测

（1）0.8%琼脂糖凝胶配置

称取0.8g琼脂糖，置于干净的三角瓶中，加入100mL0.5×TBE缓冲液，在沸水浴或微波炉中加热，使之彻底溶化后，加入5μLEB（使之终浓度0.5μg/mL）混匀，配制成0.8%的琼脂糖溶液。

（2）凝胶板准备

将上述琼脂糖溶液倒入凝胶板模具，静置，待其彻底凝固后拔出样品梳。

（3）加样

将凝胶板放置于含1×TBE的电泳槽中，缓冲液要没过凝胶表面。取DNA样品，按体积（上样缓冲液∶DNA样品＝1∶5）比例加入上样缓冲液，混合均匀后小心地加入凝胶板的加样孔中。按同样方法在附近加样孔中加入DNAmarker，作为参照。

（4）电泳与观察

以5 V/cm电压开始电泳，当指示剂泳到一定距离后，停止电泳，取出凝胶板，于凝胶成像系统中观察并拍照记录。

3.PCR检测

根据上一步电泳检测的结果，结合PCR试剂盒使用说明书，设定PCR反应体系。提前预热PCR仪，设置反应参数。

（1）PCR 10μL反应体系如下：

10×PCR buffer　　　　　　　　　　　　1μL

dNTPs mixture（2.5mmol/L）　　　　　1μL

引物（pf和pr）　　　　　　　　　　各0.5μL

Taq DNA聚合酶（5U）　　　　　　0.25μL

模板DNA　　　　　　　　　　　　　0.5μL

ddH2O　　　　　　　　　　　　　加至10μL

（2）PCR反应参数如下：

4.聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

（1）清洗电泳槽、玻璃板、齿梳等，安装好电泳槽，底部用1%琼脂糖封底胶封好，待琼脂凝固后开始灌胶。

（2）配好6%聚丙烯酰胺凝胶即变性胶，混匀的凝胶液小心地倒入凝胶模具内，防止出现气泡。灌胶口插入齿梳，约30min后胶凝固，加入电极缓冲液。

（3）预电泳15min后，在10μL扩增产物中加入2μL6×上样缓冲液混匀，点样，以2～10 V/cm电压电泳，电泳时间足够长，使片断足以分开，待指示剂到适宜位置时停止电泳，取出凝胶板。

（4）电泳结束将凝胶板放入10%的冰乙酸中脱色，置于摇床缓慢匀速轻摇，约30min，至凝胶指示剂无色。换用蒸馏水漂洗2次，每次1～2min。

（5）凝胶板经漂洗后放入0.1%染色液中，轻摇20～30min。再换用蒸馏水漂洗2次，每次1～2min，然后放入预冷的显影液中，轻摇5～10min，至DNA条带出现。

（6）将显出DNA条带的凝胶板用蒸馏水漂洗几次，水中保存，观察统计并拍照。

预期实验结果

找到2个SSR标记在籼、粳水稻品种中表现出的不同带型。

要点及注意事项

1.掌握水稻DNA及RNA提取方法。

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳检测中，丙烯酰胺和交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰胺均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩，纯化应在通风橱中进行。勿用手接触灌胶面的玻璃，以防凝胶板和玻璃板剥离，产生气泡和滑胶，或者剥胶时凝胶板易断裂，故所用器材均应严格清洗。

作业与思考题

1.了解各种分子标记。

2.掌握分子标记分析动植物多态性的方法及原理。

参考文献

1.张利达.植物基因相关SSR序列调控及位点多态性研究［D］.上海：上海交通大学.2010.

2.唐荣华,张君诚,吴为人.SSR分子标记的开发技术研究进展［J］.西南农业学报.2002，15（4），106-109.

3.陈仲中,汪旭升.基于水稻基因组序列SSR的多态性分析［J］.中国水稻科学，2005，19（4）：303-307.

（李晓峰）