实验目的

1.学习并掌握拟南芥T-DNA插入突变体筛选目的和过程。

2.掌握TAIL-PCR鉴定T-DNA插入序列信息的原理和方法。

实验原理

拟南芥T-DNA插入突变体高通量（全基因组）筛选方法多样，需根据筛选目的而定。目前筛选突变体几乎都需要利用生理生化等方法定向鉴定表型获得。如利用根弯曲筛选环境胁迫相关的突变体，就是利用根的向地性生长会受到培养基中胁迫因子（如高盐、重金属离子等）的影响而停止生长的原理，可以筛选到相关的抗性和敏感突变体。将通过表型初筛得到的F0代种植后单株收种，得到的F1代就可以鉴定目的基因了。

CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide）是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中（＞0.7mol/LNaCl），CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物，但不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后，加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。通常采用机械破碎植物细胞，然后加入CTAB分离缓冲液将DNA溶解出来，再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNA。

TAIL-PCR（thermal asymmetric interlaced PCR）是一种分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术，可以用来鉴定植物基因组中T-DNA的插入位点。该技术利用3个根据已知Ti载体序列设计的嵌套特异性边界引物（TR或TL）分别和简并引物AD组合进行PCR反应，选择恰当退火温度对目标片段进行PCR扩增。TAIL-PCR共分3次反应。在首轮PCR中，以AD/TR1为引物扩增右边界（以AD/TL1扩增左边界），然后取首轮PCR产物为模板，以AD/TR2（AD/TL2）进行二次PCR，再以二次PCR产物为模板，AD/TR3（AD/TL3）为模板进行第三轮PCR，将第2、3轮的PCR产物进行电泳分析，可以从突变体中获得带有T-DNA左右边界的旁侧序列，再通过序列比对得到T-DNA插入序列信息。

实验用品

1.材料

野生型拟南芥种子、拟南芥T-DNA插入诱变突变体库种子。

2.试剂

（1）2×CTAB提取缓冲液：100mmol/LTris-HCl（pH8.0），20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，2%（W/V）CTAB，40mmol/L巯基乙醇，灭菌。

（2）异丙醇

（3）10×PCR buffer

（4）25mmol/LMgCl2

（5）dNTPs mixture

（6）Taq 酶

（7）氯仿-异戊醇（24:1）

（8）70%乙醇

（9）液氮

（10）引物：

pBIB-BASTA TR1: CCA TCG CCC TGA TAG ACG GTT T

pBIB-BASTA TR2: CAA CCC TAT CTC GGG CTA TTC TT

pBIB-BASTA TR3: CCG CTT GCT GCA ACT CTC TCA

AD1 Primer: NTC GAS TWT SGW GTT

AD2 Primer: NGT CGA SWG ANAWGA A

AD3 Primer: WGT GNAGWA NCA NAG A

实验操作程序

（一）拟南芥T-DNA插入突变体筛选

在用除草剂BASTA 筛选转化植株F0代时,会出现一些直接可观察到表型的突变体植株，拍照、单株收种，待后续插入基因鉴定。但绝大多数F0代植株不表现特殊表型，需要用一些筛选方法定向选择突变体，如抗逆性筛选等。将通过表型初筛得到的F1代种植后单株收种，得到的F2代就可以进行插入基因鉴定。

（二）提取基因组DNA

1.取1～50g新鲜植物材料（如嫩叶），于液氮中快速研成粉末。

2.将粉末转入预冷的1.5mL离心管中，立即加入等体积2%CTAB提取缓冲液，65℃保温1h，其间不时摇动。(www.daowen.com)

3.加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1），轻缓颠倒混匀，12 000r/min离心10min。

4.将上清液转入另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒混匀，12 000r/min离心5min。

5.将上层水相转入新的离心管中，加入0.7体积的异丙醇，混匀，室温下放置30min。

6.12 000r/min离心10min，弃去上清液。

7.70%乙醇漂洗2次，12 000r/min离心2min，沉淀吹干。

8.风干后加入30～50μL的TE缓冲液溶解DNA，-20℃保存备用。

（三）TAIL-PCR

1.3次PCR反应分别按表19-Ⅲ-1加样体系进行。

2.按表19-Ⅲ-2设定PCR反应参数。

3.将第2轮和第3轮反应产物分别在浓度1.0%的琼脂糖凝胶上样，进行凝胶电泳（参照实验十八-Ⅲ中PCR检测方法）。当第2轮比第3轮反应产物略大，约为TR2和TR3引物间区段大小时，可以扩大反应体系至50μL，重新扩增。

表19-Ⅲ-1　PCR反应加样体系

表19-Ⅲ-2　PCR反应参数

4.第3轮反应产物通过凝胶电泳分离后，将条带切割下来放入干净的1.5mL离心管中，直接送去生物公司测序或者进行凝胶回收后再送样测序。

5.测序后得到的序列信息可以直接在网站（　　　http://www.arabidopsis.org/）上通过Tools＞BLAST进行序列比对，最终得到详细的插入基因信息。

预期实验结果与分析

如果扩增到目的片段，就会在电泳中同时出现第2、3轮反应的条带（图19-Ⅲ-1），且第2轮产物条带较靠近点样孔。

要点及注意事项

1.突变体表型筛选时必须同时有野生型和未处理组作为对照实验。

2.提取DNA的所有操作均需温和，避免剧烈震荡。

3.所用有机溶剂均对人体有害，需要在通风橱中进行。

4.抽提上层水相时要小心，切勿吸取中间白色带（主要是蛋白和核酸）造成DNA污染。

5.提取DNA沉淀要尽量干燥，完全去除有机溶剂（主要是乙醇）。

作业与思考题

1.提取DNA过程中加有机溶剂的作用是什么？

2.TAIL-PCR反应后如何选择有意义的实验结果？

图19-Ⅲ-1　TAIL-PCR第2、3轮产物电泳

（引自Liu et al.,2005）