实验目的

了解拟南芥人工诱变及建立拟南芥突变体库的基本原理与方法。

实验原理

EMS（甲基磺酸乙酯）是一种烷化剂，通过将烷基加到DNA的鸟嘌呤核苷酸上，使DNA在复制时错误地将G-C碱基对转换为A-T碱基对，从而引起点突变。其优点是：①突变频率高；②基因突变会产生多种效应，如基因功能完全缺失或部分缺失、基因功能的数量性变化等；③有可能获得双突变体，尤其是对于在基因单突变状态下没有表型的双突变体的获得。

T-DNA是农杆菌Ti或Ri质粒上的一段DNA序列，可以通过农杆菌感染宿主细胞稳定整合到植物核基因组中，是植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体。天然未修饰的农杆菌T-DNA上由于携带一段致瘤基因，会在农杆菌感染植物后诱发根瘤或产生发根，因此在研究应用中，首先需要通过人工改造去除致瘤基因区，然后将改造后的TDNA整合到一个既能在农杆菌中复制也能在大肠杆菌中复制的穿梭质粒中得到一个双元Ti载体。人们只要将目的基因插入到双元载体中的T-DNA区，就可以借助农杆菌的感染实现外源基因在植物基因组的整合。整合位点一般是随机的，如果T-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入外显子区，将使该基因功能丧失、发生突变。

Ti质粒通过农杆菌转化拟南芥后才能整合到植物基因组中。现在最常用的方法是花序浸染法，即将野生型植株的花序（蕾）浸润在一定浓度的农杆菌转化液中（加少量表面活性剂Silwet-L77），然后继续培养使其结实。通过这种方式，农杆菌可以穿过植物细胞壁和质膜，侵染胚囊，并将带有目的基因和元件的T-DNA片段整合到雌配子的基因组上。在双元载体的T-DNA片段上一般还带有抗生素［如潮霉素（Hygromycin）或除草剂（BASTA）］抗性基因，它们能够与目的基因一起整合到植物基因组上，使得阳性的目的基因转化子同时具有相应的抗性，便于筛选。因此，我们可以将转化后收集到的种子即F0代铺种在含有抗生素的MS培养基上，直接筛选出整合有外源基因的幼苗。由于转化只发生在雌配子体，所以F0代植株都是转基因的杂合子。其后代F1的抗性如果符合3∶1的分离比，则表明T-DNA为单拷贝插入，否则可能有多个拷贝插入位点。单拷贝的F2代植株中，可以根据后代是否全部有抗性分离找到纯合的单株。

实验用品

1.材料

野生型拟南芥种子、根瘤农杆菌菌株GV3101、质粒pBIB-BASTA。

2.试剂

（1）TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl（pH7.4），1mmol/LEDTA，灭菌。

（2）100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.5）。

（3）0.2%～0.4%（V/V）甲基磺酸乙酯（EMS）。

（4）除草剂BASTA：有效成分为5.78%草铵膦（glufosinate-ammonium）。

（5）利福平、卡那霉素、庆大霉素。

（6）渗透培养基：1/2 MS液体培养基中加入5%蔗糖和0.05%SilwetL-77（表面活性剂），灭菌20min。

（7）YEP液体培养基：10g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，5g/L牛肉膏，溶于1 000mL蒸馏水中，调pH7.0，灭菌20min。

3.器具

高速离心机、恒温振荡器、分光光度计、移液枪、花盆或格状分离的多穴塑料盘、镊子、离心管、移液枪头、离心管盒、移液枪头盒、三角瓶、保鲜膜等。

实验操作程序

（一）EMS化学诱变建立拟南芥突变体库

1.称取1g（约50 000粒）野生型拟南芥种子水中浸泡，在4℃下放置过夜。

2.把种子转移到盛有30mL100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.5）的三角瓶中，加入0.2%～0.4%（V/V）的甲基磺酸乙酯（EMS），封口后置于25℃温箱中振荡12h。

3.倒掉EMS。(www.daowen.com)

4.用蒸馏水漂洗种子10次，即获F0代。

5.将漂洗好的种子置于4℃春化3d后播种。

6.单株或混合收获F1代种子用于突变体筛选。

（二）建立拟南芥T-DNA插入突变体库

1.将0.1g（约5 000粒）野生型拟南芥种子浸泡在蒸馏水中4℃处理3d。将营养混合土装入96穴的黑色秧盘中，以密度为100～120株/盘播种上述处理后的种子。

2.当拟南芥的主枝开始现蕾时（约1月），打顶，以促进侧枝生长。

3.农杆菌转化前1d去掉已结实的果荚。

4.农杆菌菌株为GV3101（携带质粒pBIB-BASTA），挑单菌落于YEP液体培养基中，28℃下振荡培养2d。

5.加抗生素利福平、卡那霉素和庆大霉素（终浓度各为50μg/mL）的YEP液体培养基中扩大培养至指数生长中期（菌液OD600≈1.5）。

6.3 000r/min离心10min，弃去上清液。将沉淀重新悬浮于渗透培养基，菌液浓度调至OD600≈0.8。

7.将拟南芥的花序倒放到含有农杆菌的转化介质中浸泡1.5min。

8.加盖保鲜膜覆盖，避光放置1～2d，保持相对湿度大于95%，以利于农杆菌侵染转化。2d后去膜长日照培养。

9.1周后按上述方法重复转化1次。

10.待种子成熟后收获F0代、干燥。

11.筛选拟南芥F0代的种植方法同上，但将播种密度增加为约5 000株/盘。待苗出齐后，喷施除草剂Basta（有效成分为5.78%草铵膦），筛选对除草剂有抗性的转化植株F0代。除草剂使用时按体积比1∶1 000用水稀释，每7d喷施2次，连续21d。转化植株随机每20株混合采收成为1个突变体pool（F1）。

要点及注意事项

1.EMS剧毒，操作避免直接接触。

2.农杆菌转化液避免滴入土壤中。

3.农杆菌转化后需要保持较高湿度，用保鲜膜覆盖育苗盘。

4.F0代植株可以根据总植株数每几十株一起收种子，放入不同信封袋中干燥保存，用于高通量突变体筛选。

作业与思考题

1.实验中应注意哪些安全事项？

2.简述适宜农杆菌转化的拟南芥植株的生长期特征。