实验目的

1.了解拟南芥的形态、生活史及其在植物科学研究中的应用。

2.学习并掌握拟南芥的栽培和杂交技术。

实验原理

干燥的拟南芥种子经过低温春化后可以在土壤中生长，或在无菌条件下在人工配制的各种培养基中生长。自然界中拟南芥通过自交方式完成生殖过程，因此研究中可以通过人工杂交方法确定拟南芥突变体植株的遗传背景，如某一表型现象受到单基因控制，通过杂交可以得知该基因的等位基因产生的遗传学效应及其显隐性关系等。人工杂交的另一用途就是可得到带有人工标记或多基因突变体的植株。

实验用品

1.材料

干燥的拟南芥种子。

2.试剂

（1）无菌蒸馏水。

（2）1%NaClO溶液。

（3）营养土、蛭石、珍珠岩。

（4）MS培养基母液：大量元素（10×，1 000mL）、微量元素（1 000×，100mL）、有机物（100×，100mL）、铁盐母液（100×，100mL），4℃保存，配方见附录三。

3.器具

超净工作台、高压灭菌锅、电子天平、花盆或格状分离的多穴塑料盘、镊子、封口膜、培养皿，移液枪、枪头，枪盒、托盘、塑料膜、丝线、竹签、标签纸、干燥器等。

实验操作程序

（一）温室栽培

1.栽培拟南芥的介质均要求有良好的排水性，因此一般使用混合砂子、蛭石等惰性介质，保持良好的排水，防止过湿引起真菌和昆虫幼虫滋生。珍珠岩∶蛭石∶营养土=1∶1∶8的混合物进行高压灭菌处理20min，以杀死可能存在于混合物中的虫卵和杂草籽。将灭菌后的土壤混合物置于小花盆或格状分离的多穴塑料盘中，在托盘中倒入适量水或营养液，靠毛细管作用浸湿介质，将托盘中多余水排尽。

2.然后将2～4℃下无菌水中春化处理2～4d的种子，用移液枪头小心移至土表，均匀播下。种子发芽期间必须保持高湿度，故容器可用塑料膜覆盖，保持1周左右方可揭去。

3.将小花盆或多穴塑料盆移至温室，室温21±2℃，最适光强度为120～150μmol/（m2·s），光周期为16h光/8h暗，在5d左右可见拟南芥发芽。

4.在种子发芽后的头几周里，理想的供水是来自毛细管式由下至上的渗水，只有当土壤呈现干旱时才适时灌溉。过量供水会引起土表真菌的生长。在拟南芥最初两片真叶开始伸展之前必须避免干旱，当真叶长出后，灌水频率可相应减少，如每周一或两次，而至长角果充实阶段必须保证水分供应，以利于种子形成。浇水时最好待90%左右的穴盘或花盆完全干燥之后进行。

5.在长成植株后，可采取花盆外加罩子或扎绑法防止植株倒伏。

6.大多数实验室栽植的拟南芥品种在发芽后3周开花，而在6～8周后采集种子。不同拟南芥生态型的发育进程、开花时间、成熟时期等除了取决于遗传性以外，也受外界环境条件的影响。

7.种子的收集

拟南芥长角果逐渐成熟时，会由绿变黄，最后成褐色。种子需要及时收获。可采取单株采集的方式，避免不同种系混杂。收获的种子应立即脱粒、清洁、干燥。

8.种子的干燥和贮存

贮存过程中影响种子寿命的主要是温度和含水量。温度越高，含水量越多，则种子寿命越短。因此，刚采集的种子必须经过干燥才能保存。其方法是将采集的种子置于干燥环境下（可加干燥剂），在室温条件下放置2～3周。

（二）无菌培养

1.MS培养基的配制方法

最常用的培养基是1倍或1/2浓度MS培养基。将MS母液稀释到工作浓度，其中加入0.7%～1%（质量/体积）的琼脂粉，1%的蔗糖，调节溶液pH为5.8～6.0。配制好的培养基与实验中所用的培养皿、枪头、枪盒、蒸馏水等都需要高压蒸汽灭菌。

2.倒平板

将灭菌后的MS培养基和培养皿在无菌条件下倒平板，平板厚度一般占培养皿厚度1/3。

3.种子消毒处理(www.daowen.com)

在培养基中播种前，必须对种子进行消毒，防止污染培养基。利用1%NaClO 浸泡10min，倒去NaClO，然后用无菌蒸馏水洗涤5～6遍。

4.种子点样

将消毒处理后的种子，用移液枪分散点布到培养基上。

5.春化

种子点布完毕后，将培养基密封，置于4℃条件下，保持低温春化3～4d。

6.培养

春化结束后，将培养基转入培养间中，培养条件为：室温21±2℃，最适光强度为120～150μmol/（㎡·s），光周期为16h光/8h暗。其正常的生长状况一般为：

植株生长10d便能移植入土壤中，无菌苗也可以直接进行生理学和分子生物学相关实验。

（三）杂交

1.取处于花期，花已完全展开且呈十字状，雄蕊呈深黄色的花作为父本。

2.取刚露白（能看见一点白色花瓣）的花作为母本。

3.用特小型眼科镊子头部小心地沿着花苞的方向拨弄几下，把花苞拨松，去掉绿色的花萼。用镊子把白色花瓣撑开，把微黄色的雄蕊剥掉（注意不要碰到中间的柱头）。

4.取下父本花的雄蕊，在母本花的柱头上轻轻擦拭数次。标记好做过杂交的这朵花（表明杂交代数、父本和母本基因型、杂交时间）。

5.过两三天，如果母本花柱头根部变为棕红色并能发育长大则表明杂交成功。

6.杂交果荚在变黄后就需要采集，充分干燥。

7.所得F1代可以再次通过杂交技术实现回交或通过自交得到F2代，通过性状分析确定基因显隐性，还可以通过基因纯杂合鉴定，分析得到多基因纯合突变体植株（见本实验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）。

（四）表型分析

拟南芥不同生态型在形态、发育、生理等方面都存在很大差异，一般实验室最常用的遗传背景是Columbia（Col）-0型。在观察植株表型时，可从直观肉眼可见的表型中先进行分析，如叶形、莲座叶数目、茎生叶数目、株高、花形、花瓣数目、颜色、雄蕊形态和数目、开花时间、叶衰老时间、角果形态和数目、结籽率、种子颜色和形态等。但有很多突变体的表型从肉眼并不能直接观察到，需要通过生理、生化、分子生物学等技术手段的检测才可以得知。

预期实验结果

在温室培养条件下，拟南芥的种子萌发、出苗，并顺利从营养生长期过渡到开花期和成熟期，获得新一代种子。同时通过对各个时期拟南芥的观察和照相，对拟南芥在各个生长期内的形态特征有所了解。拟南芥开花期各器官形态如图19-Ⅰ-1所示。

图19-Ⅰ-1　拟南芥早开花期各器官形态（引自Meinke et al,1998）

要点及注意事项

1.营养土混合物使用前要进行高压灭菌处理。

2.培养拟南芥要水分充足但不能过多。

3.杂交中每次触碰雄蕊后都需要擦净镊子尖端，不得伤害柱头。

4.每一朵花（母本）杂交后都需要标记详细，包括父本、母本、表型、时间等。

作业与思考题

1.无菌苗培养中需要注意什么事项？

2.如何证明杂交成功？