实验目的

1.了解和掌握发状根悬浮培养方法。

2.掌握标准曲线测定次生代谢产物硫苷的定量分析方法。

实验原理

植物的次生代谢（secondary metabolism）亦称次级代谢，是存在于初生代谢（primary metabolism）以外的新陈代谢过程。次生代谢产生的一大类小分子有机化合物被称为次生代谢产物、次生产物或者次生物质（secondary metabolite）。植物次生代谢产物除了与植物自身的胁迫抵御、信号转导有关外，亦是我们日常所需食品、香料与色素等的重要来源。

目前，发根农杆菌诱导的发状根培养已广泛应用于植物次生代谢产物生产。在药用植物方面，发根农杆菌Ri质粒转化植物产生的发状根建立离体培养系统，实现次生代谢物质的工业化生产，以解决中药资源的短缺问题，越来越受到人们的重视。相对于常规细胞培养和组织培养，发状根培养系统具有生产快速、不需要外源植物激素、合成次生代谢物质能力强而且稳定、并能向培养液释放部分代谢产物等优点。通过改变培养条件，发状根甚至可以合成比原来植物中高出数倍的活性物质，以及原来植物所不含有的活性成分。

硫苷是一种含硫的阴离子亲水性植物次生代谢产物，有抗氧化、抗癌、抗真菌、抗微生物、防紫外线的功能。据报道，在天然植物中已发现120多种不同的硫苷，它们存在于11个不同种属的双子叶被子植物中，其中最重要的是十字花科。硫苷在植物中不是单一存在的，一般与葡萄糖硫苷酶（myrosinase，又名芥子酶）构成一个体系。葡萄糖硫苷酶存在于特定的蛋白体中，而硫苷存在于液泡中，正常情况下两者是分离的，但当植物细胞组织被破坏时，葡萄糖硫苷酶释放出来，将硫苷水解。芸芥中含有一种叫硫代葡萄糖苷（glucosinolate，简称硫苷）的含硫次生代谢物。

本实验通过芸芥发状根悬浮培养，观察发状根的形态学差异，采用氯化钯分光光度法的实验检测手段，来测定芸芥发状根中硫苷含量。

实验用品

1.材料

芸芥（Eruca Sativa Mill）的转基因发状根，油菜（Brassica chinensis L.）种子标样。

2.试剂

（1）1/2 MS液体培养基：MS液体培养基的大量元素含量减半，其他各成分含量不变，pH5.8～6.0。

（2）2mol/L盐酸：8.3mL浓盐酸加入50mL蒸馏水中，混匀。

（3）0.354%氯化钯溶液：称取354mg氯化钯加入2mL2mol/L盐酸中，再加入少量蒸馏水，加热溶解后，用水定容至100mL。

（4）0.15%羧甲基纤维素钠溶液：称取11.5g羧甲基纤维素钠溶于少量蒸馏水中，加热溶解后，用蒸馏水定容至1 000mL。静置过夜，取上清备用。

（5）显色液：取上述（3）和（4）溶液各一份混匀（临使用前配置）。

（6）标样：已经精确鉴定过的油菜种子（每克含40.6μmol/L硫苷）。

3.器具

超净工作台、高压灭菌锅、恒温振荡器、分光光度计、电子天平、恒温水浴锅、烧杯、10mL离心管、漏斗、研钵、三角瓶（150mL）、pH计、酒精灯、滤纸等。

实验操作程序

（一）转化根液体悬浮培养

1.从生长芸芥转基因发状根的MS固体培养基中，取一定数量的、分支多、生长旺盛的发根，转入盛有50mL1/2 MS液体培养基的150mL三角瓶中，称重。

2.于恒温振荡器上，在25℃，100r/min，黑暗条件下振荡悬浮培养，每两天称重一次。

3.两周后，以培养若干天后的总重-接种时的总重的差为纵坐标，以培养时间（d）为横坐标绘制生长曲线。

（二）次生代谢产物硫苷的定量分析

1.标准曲线绘制(www.daowen.com)

（1）称100mg标样种子在研钵中研磨成粉末，转移到10mL玻璃刻度离心管中，在沸水浴中蒸10min，加煮沸的双蒸水8～10mL，沸水中再提取25min，取出后冷却，并准确定容至10mL，充分混匀后静置（室温）。离心收集上清液备用。

（2）将上清液用重蒸水按10倍梯度稀释至10-9。

（3）显色测定：取上清液原液及其梯度稀释液各0.5mL于10支10mL的玻璃刻度离心管中，各加显色液4mL，置沸水中显色反应20min，取出后冷却，以重蒸水加显色液为对照，在分光光度计上测定消光值（OD），波长540nm。

（4）绘标准曲线：以测定的OD540值为纵坐标，以每稀释度折算的硫苷含量为横坐标，绘制标准曲线，并计算出回归方程。

2.发根中硫苷含量的测定

（1）将培养的发根晾干，在50℃干燥箱内处理约20h，烘干能研磨成粉末为止。

（2）准确称取两份烘干的发根（每份100mg）在研钵中研磨成粉末，转移到10mL玻璃刻度离心管中，在沸水浴中蒸10min，加煮沸的双蒸水8～10mL，沸水中再提取25min，取出后冷却，再用双蒸水准确定容至10mL，充分混匀后静置。离心收集上清液备用。

（3）显色测定：取上清液原液及其梯度稀释液各0.5mL于10支10mL的玻璃刻度离心管中，各加显色液4mL，置沸水中显色反应20min，取出后冷却，以重蒸水加显色液为对照，在分光光度计上测定OD 540值。

（4）与标准曲线对照或者代入回归方程中计算出硫苷含量。

预期实验结果与分析

1.与在MS固体培养基中培养相比较，芸芥的发状根在1/2MS液体培养基中生长更为迅速，由于在液体中不停地振荡悬浮培养，发根的分枝及表面的根毛减少。悬浮培养表型如图18-Ⅳ-1所示。

图18-Ⅳ-1　芸芥发状根悬浮培养表型

2.硫苷含量的标准曲线如图18-Ⅳ-2 所示，回归方程为y=0.0064x+0.0249，x 表示OD 540值，y表示总硫苷浓度（μmol/L）。

图18-Ⅳ-2　硫苷含量的标准曲线

要点及注意事项

1.标准曲线测定时，移取液体体积要精确，为减小人为误差，同一种液体要一个人操作，并保证标准品的纯度。

2.加入各种试剂的顺序应按操作方法进行。

作业与思考题

1.了解各种物理、化学条件对发状根中次生代谢产物含量的影响。

2.根据测得的试样数据，从标准曲线上读出或由回归方程计算出试样溶液中硫苷含量。

参考文献

1.蒲帆.芸芥（Eruca Sativa Mill）发状根愈伤组织诱导及发状根次生［D］.兰州：兰州大学，2009.

2.张华峰，牛丽丽.植物次生代谢产物定量分析方法研究进展［J］.食品工业科技，2012，33（15），405-408.

（李晓峰）