实验目的

1.了解和掌握植物组织培养的基本原理。

2.掌握植物组织培养的无菌操作技术。

实验原理

植物转基因技术按操作方法分类有：

（1）直接基因转移方法：分为基因枪法、PEG介导的原生质体法、花粉管通道法、电激转化法等。

（2）生物介导的转化方法主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法。这其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，是目前最为常用、技术最为成熟的植物转化方法，主要用于转化双子叶植物、少数单子叶植物和某些裸子植物。

农杆菌（Agrobacterium）是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌，生活在植物根的表面，依靠由根组织渗透出来的营养物质生存。根据农杆菌侵染宿主后，在宿主受伤部位产生的表型，农杆菌可分为根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）两种。根癌农杆菌感染植物受伤部位后能形成冠瘿瘤，而发根农杆菌则形成不定根。两种农杆菌转化机理的区别见下一个实验“发根农杆菌介导的植物基因转化”。结合本实验的实际情况选用发根农杆菌。

根据农杆菌转化植物受体的不同，农杆菌介导的转化法可分为：直接接种法（叶盘法，花絮法）、外植体共培养法、原生质体共培养法。本实验利用外植体共培养法，选用十字花科中的芸芥和油菜等为材料。利用该方法转化植物受体时，首先需要进行植物转化受体材料的准备。本次实验内容是芸芥和油菜等种子的无菌苗制备。

实验用品

1.材料

芸芥（Eruca Sativa Mill）、甘蓝（Brassica oleracea）、油菜（Brassica chinensis L.）、小白菜（Brassica campestris ssp.Chinensis）种子。

2.试剂

（1）无菌水。

（2）70%乙醇。

（3）0.1%新洁尔灭。

（4）0.1%氯化汞溶液。

（5）MS培养基母液：大量元素（10×，1 000mL），微量元素（1 000×，100mL），有机元素（100×，100mL），铁盐（100×，100mL），4℃保存，配方见附录三。

（6）MS固体培养基：量取大量元素母液100mL，微量元素母液1mL，有机物和铁盐母液各10mL，加入约800mL蒸馏水中，调pH5.8～6.0，然后加入蔗糖30g，琼脂粉8g，蒸馏水定容至1 000mL，在0.105MPa（121℃）灭菌20min。

3.器具

恒温培养箱、高压灭菌锅、超净工作台、电子天平、冰箱、微量移液器、镊子、酒精灯、无菌滤纸、酒精棉球、培养皿、三角瓶（50mL、100mL）、玻璃棒等。

实验操作程序(www.daowen.com)

1.灭菌

挑选饱满、表面光滑的种子置于50mL三角瓶内，用自来水冲洗干净后，在超净工作台上，上述三角瓶中加入70%乙醇消毒30s，无菌水冲洗2～3次（每次30s），再加入0.1%HgCl2灭菌8min，最后用无菌水冲洗4～5次（每次30s）。

2.接种

将灭菌后的种子倒在无菌滤纸上，吸干表面的残液，用镊子或玻璃棒接种到MS固体培养基上，30～40粒/瓶，分散均匀。

3.培养

接种材料移至培养架，在温度25±1℃、光强1 000Lx、12h/d的条件下培养一周。

预期实验结果与分析

接种到MS无激素固体培养基上的种子，在适宜条件下萌发生长，培养5～7d后可得到长势良好的无菌苗，即可进行下一步发根农杆菌介导的基因转化实验。

要点及注意事项

1.每瓶接种30～40粒，排列均匀。

2.乙醇和升汞灭菌时间要准确，不能超时。

3.超净台上要严格无菌操作，防止污染。

作业与思考题

1.了解相关种子消毒技术。

2.了解农杆菌转化植物受体的方法。

3.预习发根农杆菌转化机理。

参考文献

1.张志元，官春云.油菜无菌苗培养前的种子消毒技术［J］.中国油料作物学报，2005，27（1）：88-91.

2.刘春明，许智宏.高等植物的遗传转化［J］.遗传，1989，11（4）：39-42.

3.任永霞，季静等.植物遗传转化方法概述［J］.河北北方学院学报：自然科学版，2005，21（6）：39-42.