实验目的

1.了解细胞微核形成的机制和毒理遗传学的实际应用及意义。

2.了解各种环境污染对生物遗传物质的改变，增强环境保护意识。

3.学习并掌握蚕豆根尖细胞的微核检测技术。

实验原理

微核（micronucleus，MCN）是真核生物细胞中的一种异常结构，它是细胞经受理化因素（如辐射或化学药剂）的诱变作用所产生的。一般认为，微核是在有丝分裂后期，丧失着丝粒的染色体断片由于不能向两极移动而游离于细胞质中，在间期细胞核形成时不能进入主核，便形成了主核之外的核块，呈圆形或椭圆形，大小应为主核的1/3以下。也有实验证明整条或多条染色体亦能形成微核。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一致，也具有合成DNA的能力。

微核是常用的遗传毒理学指标之一，指示染色体或纺锤体的损伤。由于这种损伤会因细胞受到的外界诱变因子的作用而加剧，而微核产生的概率与诱变因子的剂量呈正相关，因此可以用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度。由于大量新化合物的合成、原子能的应用以及各种各样工业废物的排出，对环境的不利影响日益加剧，这就需要有一套高度灵敏、技术简单的检测系统来监测环境的变化。微核检测就是一种比较理想的技术方法。这是因为，真核生物的测试结果更能直接推测反映出诱变物质对于人类或其他高等生物的遗传危害。目前微核检测技术已在国内外被广泛应用于辐射损伤与防护、化学诱变、新药测试、染色体遗传疾病以及癌症前期诊断等各个方面。

长期以来，微核检测系统多数是采用哺乳动物的骨髓细胞或淋巴细胞。哺乳动物的红细胞，在成熟过程中将细胞核排出，成为无核细胞，而微核却留在细胞质中不被排出。这样，只要红细胞生成过程中出现过染色体断片，就能在成熟的红细胞内看到微核。但缺点是某些只有少量胞浆的有核细胞，其核是分叶而有突起的，这类分叶及突起常常被误认为是微核，容易造成计算误差；其次，动物细胞培养需要一定的条件和时间，细胞同步化困难，微核率较低（0.2%左右）。20世纪70年代末，人们利用高等植物花粉孢子和根尖细胞作为微核检测材料，取得了良好效果，其中Te-Hsiu Ma建立了美洲鸭跖草科沼泽紫露草（Tradescantia paludosa）四分孢子期微核测试系统。该系统用低剂量的化学药剂或辐射处理时，微核率可达10%～67%，另外，该技术因具有操作简单、实验周期短、经济适用等特点而得以广泛应用。

蚕豆（vicia faba）根尖细胞的染色体大、DNA含量高，因此对诱变因子的反应敏感。利用蚕豆根尖作为材料进行微核检测试验，可准确地显示各种处理诱发畸变的效果，具有准确、快速、操作简便、有明显剂量-效应关系、适合大批量样品检测等特点。作为一种环境变异的检测手段，该系统在我国不少地区的环保部门和医疗卫生系统中得到了广泛应用。美国国家环保局也肯定了蚕豆根尖微核测试系统在环境突变性检测中的作用，针对许多环境致癌物建立了庞大的数据库，并建议在全球范围内推广。

本实验介绍了蚕豆根尖细胞微核检测技术。

实验用品

1.材料

蚕豆种子。

2.试剂

（1）无水乙醇。

（2）95%乙醇。

（3）37%甲醛溶液。

（4）环磷酰胺溶液：0.5～2.0mg/mL。

（5）卡诺固定液：无水乙醇和冰乙酸以3∶1（V/V）混合配制。

（6）水解分离液：盐酸与95%乙醇以1∶1混合配制。

（7）改良苯酚品红染液

母液A：将3.0g碱性品红溶解在100mL70%乙醇中（可长期保存）。

母液B：量取5%苯酚溶液90mL与10mL母液A混匀（此液限于2周内使用）。

苯酚品红染液：量取45mL母液B，加入6mL冰乙酸和6mL37%甲醛混合均匀。

改良苯酚品红染液：将20mL苯酚品红染液加入180mL45%冰乙酸中，再加入3.6g山梨醇，溶解混匀，室温下静置2周后可长期使用。

3.器具

恒温培养箱、显微镜、电子天平、烧杯、白瓷盘、广口瓶、培养皿、载玻片、盖玻片、滤纸、镊子、手术刀片或手术剪刀、1.5mL离心管、离心管盒、纱布、手动计数器等。

实验操作程序

1.浸种催芽

将实验用蚕豆种子按需要量清洗干净，放入盛有蒸馏水（或自来水）的烧杯中，在25℃黑暗条件下浸泡24h，期间换水1～2次。待种子吸胀后移入铺有湿润干净纱布的白瓷盘内，在25℃恒温培养箱中催芽12～24h，培养期间保持湿度。当初生根长到2mm时，选取发芽良好的种子，于25℃培养箱中继续催芽36～48h，当初生根长至1～2cm时，可用被检测液进行处理。

2.处理

选取初生根根尖生长良好、根长一致的蚕豆种子，每一处理30～50粒，放入盛有不同浓度被检测液（本实验用环磷酰胺溶液）的培养皿中，使根尖完全浸入被检测液，在25℃黑暗条件下处理根尖24～48h（此时间可根据实验要求和被检测液浓度而定）。同时，另一培养皿中用蒸馏水处理根尖，作为空白对照。

3.恢复培养

将处理后的蚕豆根尖用蒸馏水（或自来水）浸洗3次，每次2～3min，然后将洗净的种子单层摆放于铺有湿润干净纱布（或滤纸）的瓷盘中，在25℃黑暗条件下恢复培养22～24h。

4.固定

吸取约10mL卡诺固定液加入50mL广口瓶中，然后用刀片或小剪刀切取经过恢复培养的长约0.5～1.0cm的根尖10～20条，放入广口瓶内，室温下固定20～24h（固定液的用量为材料体积的15倍以上）。固定后的根尖如果不及时制片，可换入70%的乙醇溶液中，置于4℃冰箱保存备用。

借助于物理方法或化学药物的作用，迅速透入组织和细胞将之固定，使其结构和内含物如蛋白质、脂肪、糖类以及核物质与细胞器等，在形态结构上尽可能保持其完整性和真实性，同时更易于染色，可以更清楚地显现细胞的内部结构。

5.解离

用镊子取固定好的蚕豆根尖，放入1.5mL离心管内，加入水解分离液1mL，室温下处理8～20min后，倒去水解分离液，再加入卡诺固定液1mL，软化5min（软化对细胞壁起腐蚀作用）。然后倒去固定液，用蒸馏水反复冲洗，直至材料呈白色微透明，以镊子柄轻压能压碎为佳。

水解分离的作用是去除细胞内未经固定的蛋白质,同时使胞间层的果胶类物质解体，细胞分散而易于观察。

6.染色和压片(www.daowen.com)

将蚕豆根尖顶端白色透明部分切下，放在载玻片上再纵横切成小段，以十字压片法覆以载玻片，用镊子柄或铅笔头轻敲几下，再用拇指用力下压使细胞充分分散（注意不要搓动玻片），然后轻轻分开两片载玻片，各滴加1～2滴改良苯酚品红染液，染色5～10min后加上盖玻片（需小心操作，防止产生气泡），最后用吸水纸吸去多余染液，就可进行镜检统计。

7.镜检

将制片放在显微镜低倍镜下观察，找到分生组织区域后，选择细胞分散均匀、不重叠、细胞无损、染色良好的部分在高倍镜下观察，统计细胞微核率和各个不同时期染色体的畸变情况，如染色体后期桥、染色体不均等分裂、落后染色体、染色体数目异常和多联体等。

每一处理观察3个根尖，每个根尖至少计数200个细胞，统计其中含微核的细胞数（表17-1）。根据下式计算微核的千分率（MCN‰）作为检测指标。根据实验结果，可采用数理统计的方法进行分析比较。

MCN‰＝观测到微核的细胞数/观测到的细胞总数×1 000‰

根据下式可计算被检化学药剂的污染指数。如果进行污水检测，即可鉴定所测水样的污染程度。

污染指数（PI）＝样品微核千分率平均值/对照组微核千分率平均值

表17-1　蚕豆根尖微核检测统计表

附1：微核识别标准

（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。

（2）微核着色与主核相当或比主核稍浅。

（3）微核形态为圆形、椭圆形或不规则形。

附2：污染指数

（1）在0～1.5之间为基本没有污染。

（2）在1.5～2.0之间为轻度污染。

（3）在2～3.5之间为中度污染。

（4）在3.5以上为重度污染。

预期实验结果与分析

1.许多实验已经证实，诱变物质的剂量和微核率的高低及染色体结构的畸变率呈正相关，因此，可通过检测微核率和染色体结构的畸变率来评价诱变物质的遗传毒性。

2.化学药剂等处理过程中所产生的落后染色体或落后染色体组也能以较大形式的微核出现，大、小微核形成的机制不同，但都可作为染色体变化的指标。

3.显微镜下，蚕豆根尖细胞中的微核呈圆形、椭圆形或不规则形，还可见染色体断片和染色体桥等（图17-1）。

图17-1　蚕豆根尖细胞中的微核及染色体断片（箭头所指）

要点及注意事项

1.各种诱发微核的处理试剂都具有一定的毒性，使用时要注意安全，并防止污染环境。

2.环磷酰胺使用剂量过大，会导致细胞核变形，而非形成微核，故在实验中应多设浓度梯度处理或进行预实验。

3.经过固定的材料如不及时使用，可以先经90%乙醇处理0.5h，再换入70%乙醇中，0～4℃可暂时保存，到观察时先用90%乙醇处理0.5h，然后转入固定液中。

4.对严重污染的液体环境进行检测时，用被检测液直接处理可能会造成根尖细胞死亡，应稀释后再进行测试。

作业与思考题

1.微核检测实验在环境评价中有何意义？

2.微核产生的原因和物质基础是什么？

3.一般良好的自然环境中，动物或植物的细胞是否会出现微核？为什么？

4.有一种粉末状的化学制剂，如何确定它是否有致突变的作用？

参考文献

1.乔守怡.遗传学分析实验教程［M］.北京：高等教育出版社，2008.

2.王金发，戚康标，何炎明.遗传学实验教程［M］.北京：高等教育出版社，2008.

3.李雅轩，赵昕.遗传学综合实验［M］.北京：科学出版社，2006.

（牛炳韬）