实验目的

1.了解粗糙链孢霉的生活周期及生长特性。

2.通过对粗糙链孢霉杂交后代的表型分析，掌握顺序四分子的遗传学分析方法。

3.通过有关基因的着丝粒作图，进一步理解基因的分离和连锁交换定律。

实验原理

1.粗糙链孢霉的特性

粗糙链孢霉（Neurospora crassa）又称红色面包霉，属于真菌中的子囊菌纲，球壳目，脉孢菌属，目前已知4～5种。粗糙链孢霉是低等的真核生物，对其进行遗传学分析具有以下特点：

（1）子囊孢子是单倍体，没有显隐性，其表型直接反映其基因型。

（2）一次只分析一个减数分裂的产物，就可观察到遗传结果，简单易行。

（3）体积小，易培养，繁殖快，一次杂交就能产生大量的后代，便于获得正确的统计学结果。

（4）既能进行有性生殖，又能进行无性生殖，其染色体的结构和功能类似于高等动植物，研究结果可在遗传学广泛应用。

（5）子囊孢子在子囊中的线性排列顺序，与减数分裂中期染色体在赤道板两侧的排列顺序相同，便于观察。

因此，粗糙链孢霉是进行基因分离和连锁交换遗传分析的好材料。

2.粗糙链孢霉的生活史

粗糙链孢霉的生殖方式有无性世代和有性世代（图15-1）。

无性世代（单倍体世代）：粗糙链孢霉的菌丝体是单倍体（n=7），每一菌丝细胞中含有几十个细胞核，由菌丝顶端断裂形成分生孢子。分生孢子有两种，小型分生孢子中含有一个核，大型分子孢子中含有几个核。分生孢子萌发成菌丝，可再生成分生孢子，周而复始，这样形成粗糙链孢霉的无性生殖过程。

有性世代（二倍体世代）：粗糙链孢霉的菌株具有两种不同的接合型（mating type），用mt＋、mt－表示。不同接合型的菌株结合则进入有性生殖过程，其有性生殖过程有两种方式：

（1）当菌丝在有性生殖的杂交培养基上增殖时，就会产生原子囊果（子实体），内部附有产囊体，若另一接合型分生孢子落在原子囊果的受精丝上时，分生孢子的细胞核进入受精丝，到达原子囊果的产囊体中，形成接合型基因的异核体。进入原子囊的分生孢子，进行多次有丝分裂，形成多个单倍体核，这些单倍体核与子实体中的单倍体核融合，形成多个二倍体核，然后进入减数分裂。每个二倍体核产生4个单倍体核（四分子），再进行一次有丝分裂，形成8个核，最后成为一个子囊中的8个子囊孢子，顺序地排列在一个子囊中。

（2）不同接合型的菌丝相接触，两核配对，但不融合，形成双核体，随着双核体菌丝的发育，子囊壳中形成很多伸长的囊状孢子囊，即子囊进行发育。在这些尚未成熟的子囊中含有融合以后形成的二倍体合子。合子形成以后很快在子囊中进行减数分裂，形成4个减数孢子，再进行一次有丝分裂，形成8个单倍体的子囊孢子，而整个子囊壳就成为成熟的子囊果。

图15-1　粗糙链孢霉的生活史

3.顺序四分子（ordedtetrad）

粗糙链孢霉减数分裂的四个产物保留在一起，称为四分子。由于在分裂的过程中子囊的外形比较狭窄，以至分裂的纺锤体不能重叠，只能纵立于它的长轴中，这样所有分裂后的8个子囊孢子都排列成行，所以，链孢霉减数分裂所产生的四分子是顺序四分子（ordedtetrad）。

顺序四分子在遗传分析上有很多优越性：

（1）可以把着丝粒作为一个座位（locus），计算基因与着丝粒的重组率，即着丝粒作图。

（2）子囊中子囊孢子的对称性证明减数分裂是一个交互过程，而非单向过程。

（3）可以检验染色单体的交换是否存在干涉现象。

（4）还可利用它来进行基因转变（gene conversion）的研究。

（5）证明双交换不仅可以包括4线中的2线，而且可以包括3线或4线双交换。

4.着丝粒作图与遗传分析

利用四分子分析法，测定基因与着丝粒之间的遗传距离称为着丝粒作图。在链孢霉子囊孢子的形成过程中，减数分裂前期同源染色体的非姊妹染色单体在着丝粒和某杂合基因座间是否发生交换，其产物四分子中的等位基因在排列方式上是不同的。可分为两种情况：没有发生交换的第一次分裂分离（firstdivision segregation）或称为MI模式（图15-2）；发生了交换的第二次分裂分离（seconddivision segregation）或称为MⅡ模式（图15-3）。

图15-2　第一次分裂分离（图示一种可能性）

图15-3　第二次分裂分离（图示一种可能性）

利用四分子分析，即根据子囊孢子基因型的排列顺序，计算基因与着丝粒的重组率，确定基因与着丝粒之间的距离。

本实验由赖氨酸缺陷型（Lys－）与野生型（Lys＋）杂交，得到的子囊孢子为4个黑色的（＋）和4个灰色的（－）。黑色孢子是野生型；而赖氨酸缺陷型孢子成熟迟，在野生型孢子成熟变黑时，还未变黑，而呈浅灰色。根据黑色孢子和灰色孢子在子囊中的排列顺序，可知合子在减数分裂时，基因Lys－和着丝粒之间发生交换的情况，最终可有两大类型的子囊出现，即第一次分裂分离子囊和第二次分裂分离子囊。

第二次分裂分离子囊的出现是由于有关的基因和着丝粒之间发生了一次交换的结果。即凡由第二次分裂分离形成的子囊为交换型子囊，而由第一次分裂分离形成的子囊为非交换型子囊。第二次分裂分离的子囊越多，则有关基因和着丝粒之间的距离越远。所以由第二次分裂分离子囊的频度可以计算某一基因和着丝粒之间的距离，称之为着丝粒距离。由于交换仅发生在二倍体的四条染色单体中的两条之间，所以交换型子囊中仅有一半子囊孢子属于重组类型，因此可根据下列公式求出着丝粒与有关基因之间的重组值或图距：

重组值除去%号，即作为图距

实验用品

1.材料(www.daowen.com)

粗糙链孢霉野生型菌株（Lys+，mt＋）；

粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型菌株（Lys-，mt－）。

2.试剂

（1）5%次氯酸钠（NaClO）溶液。

（2）5%的石炭酸（苯酚）溶液。

（3）微量元素溶液：配方见附录二。

（4）基本培养基、马铃薯培养基、杂交培养基、玉米杂交培养基：配制方法和灭菌条件见附录二。

（5）补充培养基（培养赖氨酸缺陷型）：在1 000mL马铃薯培养基或基本培养基中补加0.1g赖氨酸。

3.器具

超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、电子天平、显微镜、酒精灯、镊子、解剖针、接种环、载玻片、具塞试管（φ18mm×180mm）、培养皿（φ90mm）、滤纸、烧杯、量筒等。

实验操作程序

1.菌种活化

为使菌种生长得更好，先要进行菌种活化。将粗糙链孢霉野生型和赖氨酸缺陷型菌种从冰箱中取出，在超净工作台上，分别接种到两支马铃薯培养基（或基本培养基）斜面上，28℃恒温箱培养7d左右，到菌丝的上部有分生孢子产生时。

2．杂交

接种亲本菌株，可采用下述两种杂交方法：

（1）同时在玉米杂交培养基滤纸条上接种两亲本菌株的分生孢子或菌丝，25℃恒温箱进行混合培养。注意要贴上标签，写明亲本菌株及杂交日期。在杂交后5～7d就能看到许多棕色的原子囊果出现，以后原子囊果变大变黑成子囊果（图15-4），在7～14d左右，就可在显微镜下观察。

（2）在杂交培养基上接种一个亲本菌株，25℃培养5～7d后即有原子囊果出现。同时准备好另一亲本菌株的分生孢子，悬浊于无菌水中（近于白色的悬浊液），将此悬浊液加到形成原子囊果的培养物表面，使表面基本湿润即可（每支试管约加0.5mL），继续在25℃培养。原子囊果在加进分生孢子1d后即可开始增大变黑成子囊果，7d后即成熟。

3．显微镜观察

用镊子将杂交培养基上长有子囊果的滤纸条取出，放入5%次氯酸钠溶液中。取一载玻片，滴1～2滴5%次氯酸钠溶液，然后用接种针挑出子囊果放在载玻片上，取另一载玻片重叠盖上，用手指压片，将子囊果压破，置显微镜（低倍镜）下检查，即可见30～40个子囊。观察子囊中子囊孢子的排列情况（图15-5）。因为子囊果比较硬，用盖玻片压时宜破碎，所以采用载玻片压片。也可在显微镜下用镊子把子囊果轻轻夹破，挤出子囊。如发现30～40个子囊像一串香蕉一样，可加一滴水，用解剖针把子囊拨开，但要注意不能使分生孢子散出。观察过的载玻片、用过的镊子和解剖针等物都需放入5%的石炭酸中浸泡后取出洗净，以防止污染实验室。

预期实验结果与分析

图15-4　子囊果

图15-5　子囊和子囊孢子的排列

1.观察一定数目的子囊果，记录每个完整子囊的类型，按不同类型的子囊统计并填入表15-1中，根据统计结果计算出Lys基因与着丝粒的距离。

本实验用的赖氨酸缺陷型菌株为Lys-，Lys-基因座位于第六连锁群，着丝粒距离约为14.8图距单位，可供实验结果计算时参考。

表15-1　粗糙链孢霉杂交结果统计表

2.有时会观察到表15-2所示的异常子囊类型。这些子囊类型的出现除观察时间的影响外，第一种4∶4的异常排列，可能的原因是子囊孢子形成过程中，减数分裂之后进行有丝分裂时，纺锤体的重叠造成第4和第5孢子的位置互换。其他类型则是由于基因转换（gene conversion）造成。

表15-2　粗糙链孢霉杂交结果中异常子囊类型

要点及注意事项

1.杂交后培养温度控制在25～28℃之间，30℃以上温度会抑制原子囊果的形成。

2.赖氨酸缺陷型的子囊孢子成熟较迟，当野生型的子囊孢子已成熟变黑时，缺陷型的子囊孢子还呈灰色，所以要选择合适的观察时间，过早子囊孢子全为灰色，过迟却都为黑色，分不清子囊类型。在子囊壳开始变黑时，每天压片观察，到合适时期置于4℃保存，再进行观察统计。

作业与思考题

1.完成表15-1，计算出Lys基因与着丝粒的距离。

2.绘图表示交换型子囊的形成过程。

3.粗糙链孢霉子囊孢子的分离和交换现象，与高等动、植物的性状分离和基因交换有什么异同？

参考文献

1.盛祖嘉.微生物遗传学［M］.北京：科学出版社，1981.

2.Fincham J R S.Dayand P R.Fungal Genetics［M］.4th ed.Blackwell Scientific Publications，1979.

3.王金发，戚康标，何炎明.遗传学实验教程［M］.北京：高等教育出版社，2008.

（陆卫）