实验目的

1.了解大肠杆菌普遍性转导的原理。

2.掌握普遍性转导的实验操作方法。

3.学会利用普遍性转导进行基因定位的方法。

实验原理

1951年，Joshua Lederberg 和Norton Zinder 在研究多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌的遗传重组时，发现了普遍性转导这一重要的基因转移途径。法国遗传学家、分子生物学家Francois Jacob和Jacques Monod两人，通过对大肠杆菌乳糖代谢调控机制和大量影响乳糖代谢的突变型的多年研究，于1961年提出了乳糖操纵子学说，在分子水平揭示了基因表达规律，被称为分子遗传学发展史上的第三个里程碑，1965年两人获得诺贝尔生理学或医学奖。

转导是指以噬菌体为媒介，将供体菌的部分遗传物质传递给受体细胞的过程。转导通常分为普遍性转导和局限性转导。普遍性转导是指噬菌体能转导供体菌染色体的任何基因，局限性转导则是指噬菌体只能转导供体菌染色体的某些特定片段。普遍性转导噬菌体中，研究最多的是大肠杆菌的P1噬菌体和鼠伤寒沙门氏菌的P22噬菌体。普遍性转导P1噬菌体的蛋白质外壳中几乎只包装着寄主菌的染色体片断，它的DNA相对分子质量是5.8×107bp，约相当于大肠杆菌染色体的2%。大肠杆菌染色体的全长是100min，这样P1噬菌体外壳能包装的寄主菌DNA片段最多在相距2min 的范围内。寄主染色体的断裂是随机的，两个基因相距越近，共转导的频率越高；如果两个基因密切连锁，共转导的频率将接近1。共转导频率可利用公式F＝（1-d/L）3计算。公式中L为以分钟计算的转导DNA的长度（2min），d为以分钟计算的两个基因之间的距离。研究表明，当两个基因相距0.5min时，共转导频率为35%～95%，相距1min时，共转导频率为4%～25%，而相距1.5～1.8min时，共转导频率则小于1%。因此，利用共转导可以对距离很近的两个基因进行定位，甚至可进行基因精细结构分析。对于位置非常接近的一系列拟等位突变位点，也可以通过共转导测定它们的排列顺序。

由于每个感染细胞只有10-5～10-4的转导频率，因此通常选取某一选择性标记的转导子，以此来测定另一基因出现的频率，然后根据共转导频率确定它们之间的连锁关系。

本实验选用的转导噬菌体P1cml，clr100，带有从R因子易位而来的Tn9（携带氯霉素抗性基因，cml），clr100为温度敏感突变型，在42℃培养形成清晰噬菌斑，而在30℃则保持溶源化，形成混浊噬菌斑。利用P1cml，clr100噬菌体感染受体菌，从选择培养基平板上挑选lac+转导子和trp+转导子的菌落，并通过测定lac+和T基因的共转导频率来计算两基因之间的遗传图距。

实验用品

（11.）材供料

体菌：大肠杆菌（E.coli）FD1009:Hfr sup 。

（2）受体菌：大肠杆菌（E.coli）CSH:F-trp lacZ strA thi。

（3）P1cml，clr100噬菌体裂解液。

（4）T6噬菌体裂解液（效价约109～1010PFUs/mL）。

2．试剂

（1）氯仿。

（2）0.1mol/LCaCl2，灭菌。

（3）0.85%生理盐水，灭菌。

（4）LB液体培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水定容至1 000mL，pH7.2，灭菌。

（5）LB固体培养基：在LB液体培养基中加入1.5%的琼脂粉，灭菌。

（6）LB半固体培养基：在LB液体培养基中加入0.8%的琼脂粉，灭菌。

（7）10×A缓冲液：K2HPO4105g，KH2PO445.0g，（NH4）2SO410.0g，柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O）10.0g，蒸馏水定容至1 000mL，pH7.0。

（8）葡萄糖基本培养基：10×A缓冲液100mL，20%葡萄糖20mL，1mg/mL盐酸硫胺素4mL，0.25mol/LMgSO4·7H2O 4mL，琼脂17g，蒸馏水定容至1 000mL，pH7.0。葡萄糖在0.055 MPa（111℃）灭菌20min，其他成分在0.105 MPa（121℃）灭菌20min。

（9）葡萄糖-色氨酸基本培养基：在葡萄糖基本培养基中加入10mg/mL色氨酸4mL，葡萄糖和色氨酸在0.055MPa（111℃）灭菌20min，其他成分在0.105MPa（121℃）灭菌20min。

（10）乳糖-色氨酸基本培养基：在葡萄糖-色氨酸基本培养基中，用20%乳糖20mL替代葡萄糖，灭菌条件相同。

3．器具

超净工作台、离心机、恒温培养箱、恒温振荡器、恒温水浴锅、电子天平、无菌培养皿（φ90mm）、无菌带盖试管（φ15mm×100mm）、试管（φ18mm×180mm）、无菌带盖离心管（10mL）、无菌三角瓶（50mL）、无菌离心管、无菌枪头、无菌玻璃涂棒、无菌牙签、试剂瓶、接种环、加样枪、离心管盒、试管架、镊子、酒精灯等。

实验操作程序

1.Plcml，clr100噬菌体裂解液的制备

（1）供体菌活化

接种一环供体菌（E.coli FD1009）于5mLLB液体培养基中，于30℃振荡培养过夜。

（2）供体菌培养

将1mL过夜培养菌液加入新鲜的5mLLB培养液中，于37℃振荡培养4～6h，备用。

（3）预热平衡

将LB半固体培养基融化并保温平衡于48℃水浴锅中。

（4）感染吸附

取3支无菌小试管，分别加入0.2mL上述供体菌和0.1mL的P1cml，clr100噬菌体原裂解液，混匀后在37℃保温培养20min。同时另取1支无菌小试管，加入0.2mL供体菌和0.1mLLB培养液，同样处理作为对照。

（5）双层培养

于4支试管中各加入3mL预平衡的LB半固体培养基，迅速搓匀后，再分别倒入4个LB固体平板培养基中央表面，边倒入边轻轻旋转平板，使上层培养基均匀分布于平板表面。平板凝固后倒置于37℃恒温培养箱过夜培养。

（6）制备裂解液

将含有大量噬菌斑的半固体培养基转入无菌三角瓶中，加入5～10mLLB 培养液和0.1mL氯仿，混匀，然后转入无菌带盖离心管中，剧烈振荡30s后，以4 000r/min离心10min，留取上清液用氯仿重复处理一次，离心后转移上清液至无菌离心管中，于4℃保存备用。上清液中包含P1cml，clr100噬菌体裂解液和少量包装了供体染色体片段的P1转导噬菌体颗粒。

2.P1cml，clr100噬菌体裂解液效价测定

在做转导实验时，噬菌体与大肠杆菌之间的比例要小于1，因此需要测定噬菌体裂解液的效价。其测定方法参照实验十一（λ噬菌体感染及其效价测定）。

（1）供体菌培养

取1mL在30℃过夜培养的供体菌，加入5mLLB培养液中，于37℃振荡培养4～6h。

（2）预热平衡

将6支LB半固体培养基融化并保温平衡于48℃水浴锅中。

（3）裂解液稀释：取8支无菌离心管，编号，每管各加入0.9mLLB 培养液。吸取0.1mL新制备的P1噬菌体裂解液加入1号管中混合均匀，再从1号管中吸取0.1mL加入2号管中混匀，依次按10倍梯度稀释至10-8。

（4）感染吸附

取6支无菌小试管编号，分别加入0.2mL新活化的供体菌液，然后从10-4～10-8的P1噬菌体稀释液中，各吸取0.1mL加入上述小试管，其中一支试管中加入LB培养液代替噬菌体作为对照。混匀后于37℃培养20min。

（5）双层培养

每支试管中加入3mL预平衡的LB半固体培养基，迅速搓匀后倒入6个LB固体平板培养基上，摇匀，对应编号，静置凝固。所有平板倒置于37℃过夜培养。

（6）观察统计

观察平板中不同稀释倍数的噬菌斑数，记录于表14-1。

表14-1　噬菌体效价测定记录表

(www.daowen.com)

3.trp和lac基因的转导

（1）受体菌活化

接种一环受体菌（E.coli CSH）于5mLLB液体培养基中，于30℃振荡培养过夜（16h）。

（2）受体菌培养

第二天取1mL新鲜培养物加入5mLLB培养液（含终浓度5mmol/LCaCl2）中，于37℃振荡培养2～3h。

（3）裂解液稀释

取3支无菌离心管，每管各加入0.9mL无菌生理盐水。吸取0.1mLP1噬菌体裂解液加入1管中混合均匀，依次按10倍梯度稀释至10-3。

（4）感染吸附

取4支无菌小试管，每管各加入1.5mL含CaCl2的受体菌液，然后分别加入0.1mLP1噬菌体原液和不同稀释度的裂解液，混匀。另取2支无菌小试管，1支加入1.5mL受体菌液和0.1mLLB培养液，另一支加入1.5mLLB液和0.1mL噬菌体原液，作为对照。将6支试管置于37℃保温培养20min。

（5）制备菌悬液

保温混合物经4 000r/min离心10min，弃去上清液，加入1mL无菌生理盐水悬浮沉淀，混匀，制备成菌悬液。

（6）涂布菌悬液

吸取0.1mL菌悬液涂布于乳糖-色氨酸基本培养基（4皿，其中对照1皿）和葡萄糖基本培养基（2皿，其中对照1皿），所有平板置于37℃培养2d。

（7）统计转导子

观察统计乳糖-色氨酸基本培养基平板上lac+转导子的数量以及葡萄糖基本培养基平板上trp+转导子的数量，将所有观察数据记录于表14-2。

（8）活菌计数

将受体菌液用无菌生理盐水按10倍梯度稀释至10-6，取10-5和10-6稀释液各0.1mL，分别涂布于葡萄糖-色氨酸基本培养基平板上（每个稀释度各3个平板），于37℃培养2d。统计每个平板上的菌落数，填入表14-3，并计算受体菌浓度（每mL菌液中细菌的个数）。

4.共转导与基因定位

（1）涂布裂解液

取3个LB固体平板培养基，分别涂布0.1mLT6噬菌体裂解液（效价约109PFUs/mL）。

（2）点种转导子

待裂解液被吸收后，用灭菌牙签在乳糖-色氨酸培养基上挑取约300个单菌落，分别点种于上述平板中（每皿约100个），然后置于37℃培养过夜。

（3）观察统计

观察每个平板上生长的共转导菌落数（lac+-T6r+共转导菌落），结果记录于表14-4。

预期实验结果与分析

1.P1cml，clr100噬菌体的效价测定

选取噬菌斑清晰、数目适中（30～300个）的平板，按下列公式计算P1cml，clr100噬菌体的效价（噬菌体数/每mL裂解液）：

噬菌体效价（PFUs/mL）=每皿噬菌斑数×10×裂解液稀释倍数

2.色氨酸基因（trp）和乳糖发酵基因（lac）的转导结果

表14-2　不同培养基上转导结果统计

转导频率（%）＝转导子数/噬菌体裂解液效价×100%

3.受体菌活菌计数

表14-3　受体菌活菌计数表

4.共转导与基因定位

利用下式计算乳糖发酵基因（lac+）和T6抗性基因（T6r）的共转导频率：

共转导频率（%）=共转导菌落总数/点种菌落总数×100%

利用公式F＝（1-d/L）3，计算lac+基因和T6r基因的遗传图距，进行基因定位。

表14-4　共转导频率的测定

要点及注意事项

1.每次实验，菌种要提前两天活化。

2.注意各种培养基的灭菌条件和时间有所不同。

3.噬菌体效价测定为必做的实验程序。

4.平铺上层半固体培养基的过程中，动作要快并防止污染。

5.用无菌牙签点种时动作要轻巧，切勿将培养基扎破。

作业与思考题

1.计算P1cml，clr100噬菌体的效价。

2.根据实验结果（表14-2），计算出色氨酸基因（trp）和乳糖发酵基因（lac）的转导频率。

3.根据实验结果（表14-4），计算lac+基因和T6r基因的共转导频率及其遗传图距。

参考文献

1.王亚馥，戴灼华.遗传学［M］.北京：高等教育出版社，1999.

2.王建波，方呈祥.遗传学实验教程［M］.武汉：武汉大学出版社，2004.

3.卢龙斗，常重杰.遗传学实验技术［M］.北京：科学出版社，2007.

（牛炳韬）