实验目的

1.掌握大肠杆菌λ噬菌体局限性转导的操作方法和技术。

2.理解λ噬菌体局限性转导的原理。

实验原理

转导是指以噬菌体为媒介，将供体菌的部分遗传物质传递给受体细胞的过程。通过转导，受体细胞获得外源基因，从而改变了自身的遗传性状。转导通常分为普遍性转导和局限性转导。普遍性转导是指噬菌体能转导供体菌染色体的任何基因，如大肠杆菌的P1噬菌体和鼠伤寒沙门氏菌的P22噬菌体等。局限性转导是指噬菌体只能转导供体菌染色体的某些特定片段，其机制在于噬菌体只能整合在供体菌染色体DNA的特定位置上，如大肠杆菌λ噬菌体。转导是一种有效的遗传分析实验手段，在分子遗传学实验中占有重要地位，同时也是基因精细结构分析和基因工程实验的基本技术方法之一。

大肠杆菌λ噬菌体是一种温和噬菌体，它的DNA能整合在大肠杆菌染色体中，完成溶源化过程。在溶源菌中，λ噬菌体可以维持其溶源状态而进行溶源生长，若受到某种物理、化学等因素的诱导，则进入裂解生长途径。λ噬菌体的原噬菌体附着在宿主染色体DNA上的半乳糖基因（gal，17min处）和生物素合成基因（bio，18min处）之间，因此，它既能转导gal基因，又能转导bio基因。当溶源菌（供体菌）受紫外线诱导时，释放出的λ噬菌体中只有极少数带有细菌的gal基因，而噬菌体自身则失去部分DNA片段，这种噬菌体称为缺陷噬菌体（λdg）。以该噬菌体进行转导时，大约在106个感染细胞中有一个转导子出现，称这种转导为低频转导（LFT）。用这种低频转导噬菌体裂解液以高感染复数（HIF）感染非溶源性gal-受体菌时，缺陷噬菌体和λ噬菌体一起整合到受体细胞染色体上，使之成为双重溶源菌。双重溶源菌经诱导后，释放出约占噬菌体总数50%的、具有半乳糖发酵基因功能的噬菌体。以这些噬菌体所进行的转导称为高频转导（HFT）。

本实验选用溶源性的E.coli K12（λ）gal+为供体菌，经紫外线诱导后发生裂解反应，原噬菌体被释放出。由于λ噬菌体与gal+基因紧密连锁，少数噬菌体会形成带有邻近寄主gal+基因的转导噬菌体（λdgal+），当这种转导噬菌体感染受体菌E.coli K12 Sgal-时，gal+基因与受体菌的染色体DNA发生重组，将gal+基因转移到受体菌gal-基因中，使不能利用半乳糖的gal-受体菌转变成能利用半乳糖的gal+细菌。这种由于转导而改变了遗传性状的细菌称为转导子。转导过程如下图所示：

实验用品

1.材料

（1）供体菌：E.coli K12（λ）gal+（溶源菌，λ原噬菌体整合在半乳糖基因旁）。

（2）受体菌：E.coli K12 Sgal－（染色体上半乳糖基因缺失）。

2.试剂

（1）氯仿。

（2）1mol/L硫酸镁：MgSO4·7H2O 24.67g溶于100mL蒸馏水中，灭菌。

（3）20%麦芽糖：麦芽糖20.0g溶于100mL蒸馏水，无菌0.22μm滤膜灭菌，4℃保存。

（4）LB液体培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，加蒸馏水定容至1 000mL，pH7.2，灭菌。

（5）2×LB液体培养基：LB液体培养基各成分加倍。

（6）LB固体培养基：LB液体培养基中加入1.5%琼脂粉，灭菌。

（7）LB半固体培养基：LB液体培养基中加入0.8%琼脂粉，灭菌。

（8）磷酸盐缓冲液：K2HPO4 7.0g，KH2PO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.25g，加蒸馏水定容至1 000mL，灭菌。

（9）半乳糖伊红美蓝（EMB）固体培养基：半乳糖10.0g，蛋白胨8.0g，K2HPO4 2.0g，NaCl 5.0g，伊红Y（曙红）0.4g，美蓝0.065g，琼脂粉15.0g，蒸馏水定容至1 000mL，加入伊红和美蓝之前调pH至7.2，灭菌。

3.器具

电子天平、台式离心机、恒温培养箱、恒温水浴锅、超净工作台、15 W紫外照射装置、无菌培养皿（φ90mm）、无菌离心管（φ10mL）、无菌玻璃试管（φ15mm×100mm）、无菌离心管、无菌玻璃涂棒、无菌枪头、三角瓶（50mL）、试管（φ18mm×180mm）、加样枪、接种环、离心管盒、试管架、酒精灯、镊子等。

实验操作程序

1.λ噬菌体诱导及其裂解液的制备

（1）供体菌活化

挑取一环供体菌E.coli K12（λ）gal+接种于5mLLB液体培养基中，置37℃振荡培养过夜（16h），使供体菌活化。

（2）供体菌培养

第二天，取0.5mL新鲜培养菌液加入盛有4.5mLLB培养液的三角瓶内，继续在37℃振荡培养4～6h。

（3）制备菌悬液

将三角瓶内的菌液转入无菌离心管中，3 500r/min离心10min。然后弃去上清液，加入4mL磷酸盐缓冲液，振荡混匀，制备成菌悬液。

（4）诱导裂解

取3mL菌悬液加入无菌培养皿中，置于15W紫外灯下（距离40cm）照射处理20～30s后，打开培养皿盖继续诱导处理10～20s（边照射边搅拌），使噬菌体大量裂解供体菌。

（5）避光培养

经诱导裂解后，于培养皿中加入3mL2×LB液体培养基，摇匀。为防止光复活，把培养皿用黑纸包装或置于不透光盒子中，于37℃无光条件培养2～3h。

（7）离心沉淀

将培养物转入无菌离心管中，3 500r/min离心10min。

（8）裂解液制备

将上清液转入另一无菌离心管中，加入0.2mL氯仿，剧烈振荡30s，静置5min 后，小心地把上清液转入无菌离心管中，4℃保存备用。此上清液就是λ噬菌体的裂解液，可供效价测定和转导之用。

2.λ噬菌体裂解液效价测定

（1）受体菌活化

挑取一环受体菌E.coli K12 Sgal－接种于5mLLB液体培养基（补加终浓度为1%的麦芽糖和10mmol/L的硫酸镁）中，置于37℃振荡培养过夜（16h），使受体菌活化。

（2）受体菌培养

第二天，取0.5mL新鲜培养菌液加入盛有4.5mLLB培养液（同样补加麦芽糖和硫酸镁）的三角瓶内，继续在37℃培养4～6h，作为指示菌用；剩余菌液于4℃保存，备用。

（3）预热平衡

将LB半固体培养基融化并保温平衡于48℃水浴锅中。

（4）稀释裂解液

取0.5mLλ噬菌体裂解液加入4.5mLLB液体培养基中，依次10倍梯度稀释至10-7。(www.daowen.com)

（5）感染吸附

取4支无菌小试管，编号，各加入0.5mL指示菌液，然后从10-6与10-7的噬菌体稀释液中，各吸取0.5mL加入含指示菌的小试管（每个稀释度各2支）。混匀后于37℃培养20min，使噬菌体吸附到指示菌上。

（6）双层培养

于每支试管中加入3mL预平衡的LB半固体培养基，迅速搓匀后倒入LB固体平板培养基上，摇匀，对应编号，静置凝固。所有平板倒置于37℃恒温培养箱过夜培养。

（7）观察统计

观察每个培养皿中出现的噬菌斑数，填入表13-1。

（8）计算效价

利用下式计算λ噬菌体裂解液的效价。

噬菌体效价（PFUs/mL）=两皿平均斑数×稀释倍数×取样量（折算成1mL）

3.转导实验

（1）点滴法

①取2个半乳糖EMB培养基平板，在培养皿底部用记号笔按图13-1画好。

图13-1　半乳糖EMB培养基平板画图

②将噬菌体效价测定第2步中保存于4℃的受体菌液，转至37℃振荡活化16h。

③挑取几环受体菌液，在培养皿中已画好的两个长条形宽带内涂两条菌带，然后置于37℃保温培养1.5h。

④取出平板，在4个方格和2个圆圈处各滴加一环λ噬菌体裂解液，再置于37℃培养2d。方格处为转导实验，圆圈处为λ噬菌体对照，长条形菌带为受体菌对照。

⑤观察受体菌的菌落形态和色泽，填入表13-2。既要观察在4个方格和2个圆圈中菌落的形态和色泽，也要观察4个方格以外的菌落生长情况和色泽。

（2）涂布法

①取4个半乳糖EMB培养基平板，编号，于1号皿中滴加0.1mLλ噬菌体裂解液，作为噬菌体对照；2号皿中滴加0.1mL经活化的受体菌，作为受体菌对照；其余2皿都滴加噬菌体裂解液和受体菌液各0.05mL。

②用无菌玻璃棒将上述各皿中的菌液或噬菌体裂解液涂布均匀后，置37℃培养2d。

③观察各培养皿中菌落的形态和色泽，填入表13-2。

预期实验结果与分析

该局限性转导实验中，转导区菌落呈紫褐色且具有金属光泽，噬菌体对照区无菌落出现，受体菌对照区菌落呈白色。在半乳糖EMB培养基上培养大肠杆菌时，由于E.coli K12（λ）gal+菌株具有半乳糖发酵基因，能分解半乳糖而产生大量的混合酸，可被酸性染料伊红染色，又因伊红与美蓝的结合，使菌落呈紫褐色，并且菌落表面具有绿色金属光泽，产生弱酸的菌落呈棕色。而E.coli K12 Sgal－菌株的染色体上半乳糖基因缺失，不能分解半乳糖，因而在含有伊红和美蓝两种指示剂的培养基上，菌落呈白色。

1.λ噬菌体效价测定

统计每个平板上的噬菌斑数填入表13-1，并计算λ噬菌体裂解液的效价。

表13-1　λ噬菌体效价测定结果

2.转导实验

将点滴法和涂布法转导实验统计结果填入表13-2。

表13-2　细菌的局限性转导实验结果

要点及注意事项

1.每次实验前两天活化菌种。

2.紫外线诱导处理，可使噬菌体由整合态转变为游离态，进而裂解大肠杆菌。

3.转导实验中，使用接种环和玻璃涂棒时，注意避免交叉污染。

4.点滴法转导实验中，两条菌带经培养后要比较干燥，这样，在滴加噬菌体裂解液时可减少扩散。

作业与思考题

1.计算λ噬菌体裂解液的效价。

2.对大肠杆菌λ噬菌体的局限性转导结果进行分析说明。

3.大肠杆菌普遍性转导与局限性转导的噬菌体有什么区别？

参考文献

1.乔守怡.遗传学分析实验教程［M］.北京：高等教育出版社，2008.

2.刘祖洞，汪绍慧.遗传学实验［M］.2版.北京：高等教育出版社，1987.

3.王金发，戚康标，何炎明.遗传学实验教程［M］.北京：高等教育出版社，2008.

4.王建波，方呈祥.遗传学实验教程［M］.武汉：武汉大学出版社，2004.

（牛炳韬）