实验目的

1.进一步了解λ噬菌体的特性，掌握λ噬菌体DNA的提取原理。

2.掌握提取与分析λDNA的基本技术和操作方法。

实验原理

λ噬菌体作为最早使用的一种基因工程载体，其序列已被全部测出。λ噬菌体整个基因组是由48502 bp组成的一条线性双链DNA，可分为左臂、中段和右臂三个部分。左、右臂（约30 kb）包含了λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体以及裂解生长所需的全部序列，中段（约20 kb）是λDNA整合、切除及溶源生长所需的序列。可见对λ噬菌体的形成、组装和裂解生长而言，占DNA链约40%的中段序列并非必需。所以利用λ噬菌体做载体，主要是将外源目的DNA插入或置换中段序列。经过改造的λ噬菌体克隆位点可插入5～20 kb的外源DNA，使其随左右臂一起包装成克隆载体。λ噬菌体可插入的外源DNA比质粒载体能插入的长得多，而且所包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高得多，缺陷是λ噬菌体载体的克隆操作比质粒载体复杂些。因此，λ噬菌体载体在组建动植物基因组DNA和cDNA文库方面具有重要用途。

λ噬菌体载体在经文库筛选得到目的克隆后，常常利用λ噬菌体裂解生长的特点，通过培养获得大量的噬菌体颗粒，并提取λDNA来开展后续工作。λ噬菌体的头部是蛋白质外壳，λDNA通常被包其中，尾部是较长的尾丝，便于吸附在受体细胞表面。在提取λDNA的过程中，λDNA的产率取决于噬菌体的产量，而噬菌体的产量在其他条件相对恒定的情况下又取决于感染初期噬菌体与宿主菌的比例。为了提高λDNA的产率，通常在液体培养中使宿主菌全部被裂解，释放出大量的噬菌体颗粒。λ噬菌体裂解培养物离心后，噬菌体被PEG/NaCl混合物冰浴沉淀，利用RNase A和DNase I 混合酶消化除去残留的宿主菌核酸，收集的噬菌体经饱和苯酚和氯仿抽提处理，保留在水相中的λDNA可经乙醇沉淀后离心收集。

琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时具有电荷效应和分子筛效应。在高于等电点的缓冲液中，DNA分子带负电荷，在电场中向正极移动。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA相对分子质量对数成反比，由于DNA分子的大小和构型不同，在相同的时间内迁移至不同的位置。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成络合物，经紫外线照射后发出荧光，可区分出不同的条带，通过与已知相对分子质量的标准DNA片段进行比较，即可知目标DNA片段的大小。琼脂糖凝胶电泳还可用于DNA酶切分析、纯度鉴定、分离纯化、Southern杂交等。

实验用品

1.材料

λ噬菌体原液，受体菌（Escherichia coli，E.coli）ER-1647。

2.试剂

（1）无水乙醇。

（2）70%乙醇。

（3）饱和苯酚。

（4）琼脂糖。

（5）三氯甲烷（氯仿）。

（6）1mol/L硫酸镁：24.67g MgSO4·7H2O溶于100mL蒸馏水中，灭菌。

（7）20%麦芽糖：2g麦芽糖溶于100mL蒸馏水，0.22μm滤膜过滤灭菌，4℃保存。

（8）3mol/L醋酸钠：40.8g NaAc·3H2O溶于约80mL去离子水中，加热搅拌溶解，用稀冰醋酸调pH至7.0，再加去离子水定容至100mL，灭菌，4℃保存。

（9）12mg/mL四环素贮备液（Tet.）：0.12g四环素溶于10mL无菌蒸馏水中，用0.22μm滤膜过滤灭菌，分装于1.5mL无菌离心管中，-20℃保存。

（10）10mg/mL溴化乙锭贮备液（EB）：10mg溴化乙锭置于离心管中，加入1mL蒸馏水，旋涡混合，直至溴化乙锭充分溶解。4℃避光保存。

（11）20%PEG 6 000/2mol/LNaCl：20g聚乙二醇6 000，加入40mL的5mol/LNaCl溶液中（或11.7g NaCl溶于50mL蒸馏水），再用蒸馏水定容至100mL。

（12）1mol/LTris-HCl（pH7.4、8.0）：配制方法见附录八。

（13）0.5mol/LEDTA（pH8.0）：配制方法见附录八。

（14）λ噬菌体悬浮液（SM）：配制方法见附录四。

（15）TE缓冲液：取1mL的1mol/LTris-HCl（pH8.0），与0.2mL的0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液混合后，用去离子水定容至100mL，灭菌。

（16）5×TBE（Tris-硼酸）缓冲液：54g Tris碱和27.5g硼酸加入约800mL的去离子水中，充分搅拌溶解，再加入20mL的0.5mol/LEDTA（pH8.0），搅拌混匀，加去离子水定容至1 000mL。室温保存。

（17）10mg/mLRNaseA0贮备液：100mg 的RNA酶溶于10mL的10mmol/LTris-HCl（pH7.5）和15mmol/LNaCl溶液中，沸水浴中煮15min，分装后于-20℃保存。

（18）10mg/mLDNaseI贮备液：使用前用TE缓冲液配制，-20℃保存。

（19）LB液体培养基：10g蛋白胨、5g酵母浸膏、10g NaCl溶于1 000mL蒸馏水，pH7.2，灭菌。

（20）上样缓冲液：0.25%（W/V）溴酚蓝和40%（W/V）蔗糖水溶液。

（21）DNA相对分子质量标准。

3.器具

超净工作台、恒温培养箱、恒温振荡器、制冰机、离心机、恒温水浴锅、旋涡混合器、电泳仪、水平电泳槽、紫外检测仪、凝胶成像系统、微量加样枪、无菌1.5mL离心管、无菌枪头、无菌带盖玻璃试管（φ15mm×100mm）、无菌带盖50mL塑料离心管、电子天平、50mL和250mL三角瓶、石蜡膜、吸水纸、一次性手套、离心管盒、试管架等。

实验操作程序

（一）按实验十一所述的方法制备λ噬菌体原液

（二）λ噬菌体DNA的分离

1.受体菌活化

取200μL受体菌液（E.coli）加入含四环素（终浓度12μg/mL）的LB液体培养基中，于恒温振荡器内30℃、250r/min过夜培养。

取一瓶10mLLB培养液，加入1mol/LMgSO4和20%麦芽糖各100μL，再加入100μL过夜培养的受体菌液，于37℃、250r/min培养5～6h，当OD600值达到1.0为止。

在过夜培养中，于30℃培养将使细胞不易长至饱和状态，培养基中细胞碎片的量也保持在最低。如果把噬菌体加入饱和培养物中，会吸附于细胞碎片上而导致无效感染。

麦芽糖可诱导细胞膜上麦芽糖外膜蛋白受体（特异的噬菌体受体）的产生，使大肠杆菌更具有敏感性，利于噬菌体的结合和吸附，该受体的合成受麦芽糖的诱导却被葡萄糖所抑制。Mg2+的存在能促进噬菌体和受体菌的吸附作用。

2．λ噬菌体裂解液制备

（1）取3瓶50mLLB培养液，每瓶加入1mol/LMgSO4和20%麦芽糖各500μL，然后置于37℃恒温培养箱预热待用。

（2）取3支无菌带盖的玻璃试管，各加入100μL活化的受体菌液，再分别加入40、50、60μL噬菌体原液并标记，于37℃、150r/min振荡培养30min。

（3）将上述感染物转入预热的50mLLB培养液中，于37℃、250r/min过夜培养。

（4）次日，可见裂解发生。每瓶中各加入2mL氯仿，于37℃继续振荡培养15min。

比较这三瓶培养物，选择培养液比较清亮、细胞碎片和絮状团块较多的一瓶，准备提取λ噬菌体DNA。液体培养裂解过程，早期培养液会变浑浊，随着继续培养而裂解发生，培养液将变得清亮；如到第二天裂解尚未发生，可适当提高培养温度或加快摇振速度。

3.λ噬菌体DNA提取(www.daowen.com)

（1）将培养物转入50mL无菌带盖的离心管中，5 000r/min，室温离心20min。

（2）将上清液平均分装到2个50mL无菌带盖的离心管中，然后每管加入等体积预冷的PEG/NaCl混合物，平衡两管质量后，混匀，冰浴60min。

（3）4℃，10 000r/min，离心30min。

（4）弃去上清液，在吸水纸上倒置5min。

（5）两离心管中各加入250μLSM液，悬浮噬菌体，然后转入一支无菌离心管中。

（6）于离心管中加入1μLDNaseI 和4μLRNaseA，混匀，37℃温育60min。

（7）加入500μL饱和苯酚，在旋涡混合器上剧烈振动30min。

（8）4℃，12 000r/min，离心5min，将上清液转至另一支无菌离心管中。

（9）加入等体积的饱和苯酚，再纯化一次。

（10）将上清液转入另一离心管中，加入500μL氯仿，振荡10s，混合。

（11）4℃，12 000r/min，离心5min，把枪尖插入下层有机相吸去有机物。

（12）加入50μL3mol/L醋酸钠，混匀。

（13）加入900μL预冷的无水乙醇，混匀后冰浴20min。

（14）4℃，12 000r/min，离心10min，沉淀DNA。

（15）弃上清液，加入1mL70%乙醇，冲洗。

（16）4℃，12 000r/min，离心10min。

（17）弃上清，重复70%乙醇冲洗和离心一次。

（18）弃上清液，倒置离心管于吸水纸上，吸去残余上清，室温干燥。

（19）加入50～100μLTE缓冲液，待DNA溶解后取10～20μL用于电泳检测，其余样品置于-20℃保存，备用。

（20）进行琼脂糖凝胶电泳，检测制备的λDNA样品。

低温有利于噬菌体颗粒的沉降，加入大分子PEG也是为了沉淀噬菌体颗粒，而NaCl的存在则促进了噬菌体颗粒与细胞碎片之间的分离。

DNaseI 和RNaseA可消化宿主细胞裂解后所释放出的核酸。这些核酸如果不经消化处理，相当大一部分噬菌体颗粒会被其黏性溶液所带走，从而降低λDNA的产率。

加入醋酸钠的作用是促进λDNA的沉淀，同时起到纯化λDNA的目的。

（三）DNA琼脂糖凝胶电泳分析

1.1%琼脂糖凝胶制备

称取1g琼脂糖，置于干净的250mL三角瓶中，加入100mL1×TBE缓冲液，在沸水浴中加热，使之彻底溶解。准备好凝胶板模具，插好样品梳，水平放置于桌面上。待琼脂糖溶液降温至60℃左右时，加入5μLEB贮备液（使终浓度为0.5μg/mL），缓慢摇动混匀后，倒在凝胶板模具上，室温放置0.5h。

2.加样

待琼脂糖凝固后，轻轻拔出样品梳。将凝胶连同凝胶板一起放置到电泳槽中，然后加入1×TBE缓冲液，使缓冲液浸没凝胶面约1mm。再于电泳缓冲液中加入终浓度为0.5μg/mL的EB贮备液混匀。取DNA样品10～20μL，按上样缓冲液∶DNA样品＝1∶5的比例吸取上样缓冲液混合于蜡膜上，然后吸取10～20μL混合物小心地加入凝胶板上的加样孔中。在附近的加样孔中加入已知相对分子质量的标准DNA，作为参照。

3.电泳

接通电源（加样孔一端接负极）。以5V/cm电压（50mA，80V）电泳2.5～3h。当溴酚蓝迁移3～4cm（可根据凝胶大小，最好距凝胶前沿约1cm）时停止电泳。

4.凝胶成像系统观察拍照

带上一次性手套将凝胶板取出，置于干净的培养皿中，于凝胶成像系统（或紫外透视仪）下观察拍照。

预期实验结果与分析

在凝胶成像系统（或紫外透视仪）下观察，通过与标准DNA条带比较，在约50 kb的位置会有一条显示橙黄色荧光的目标条带，即为λDNA分子。如果加样孔附近出现荧光条带，或溴酚蓝带前出现弥散荧光，说明DNA样品中存在DNA和RNA杂质，受体菌裂解后的核酸消化不完全。

要点及注意事项

1.用于裂解的受体菌和噬菌体最好为新鲜培养获得。

2.要获得纯度更高的λDNA，可在该实验的基础上采用氯化铯密度梯度离心、层析等其他方法纯化提取的DNA。

3.电泳时如果电压太高，DNA带会出现拖尾现象。

4.溴化乙锭（EB）是剧毒药品，使用中注意安全，防止污染环境。

作业与思考题

1.对电泳结果进行拍照，估计分离纯化所得λDNA的质量和产率。

2.制备λ噬菌体裂解液时，怎样才能大量收获噬菌体？

3.提取λ噬菌体DNA时，如何才能提高λDNA的产率及纯度？

参考文献

1.Sambrook J，Russell D W.分子克隆实验指南［M］.3版.黄培堂等，译.北京：科学出版社，2002.

2.王建波，方呈祥等.遗传学实验教程［M］.武汉：武汉大学出版社，2004.

（牛炳韬）