实验目的

1.了解噬菌体感染的原理及噬菌体效价的意义和用途。

2.掌握噬菌体感染及其效价测定的基本技术。

实验原理

噬菌体（bacteriophage，phage）是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。它们由一个保护性的蛋白质外壳包围着单链或双链DNA或RNA基因组组成。噬菌体具有病毒的一些特性：个体小、可通过除菌滤器、没有细胞结构、非常专一的寄生性等。噬菌体分布极广，凡是有细菌的场所，就可能有相应噬菌体的存在。噬菌体具有严格的宿主特异性，只寄居在易感宿主菌体内，故可利用噬菌体进行细菌的流行病学鉴定与分型，以追查传染源。由于噬菌体结构简单、基因数量少，所以是分子生物学与基因工程的良好实验体系。了解噬菌体的特性，掌握快速检测、分离和进行效价测定的方法，对于生产和科研中防止噬菌体的污染具有重要意义。

虽然噬菌体基因组含有许多个基因，但所有已知的噬菌体都是在细菌细胞中，利用细菌的核糖体、蛋白质合成时所需的各种因子、各种氨基酸及能量产生系统来实现自身的生长和增殖，因此，一旦离开宿主细菌，噬菌体既不能生长，也不能复制。当把细菌涂布在培养基面上长成一层菌苔时，每个噬菌体感染一个细菌，经过裂解周期，宿主细胞破裂后，释放出大量子代噬菌体，然后它们再扩散和侵染周围细胞，结果在菌苔上形成一个圆形清亮的噬菌斑（plaque）。噬菌斑的形成可用于分离、纯化噬菌体和进行噬菌体计数。一个噬菌斑来自最初涂布平板时的一个噬菌体，即从单个噬菌斑上获得的噬菌体就是一个噬菌体克隆，都有相同的基因组。

有一类噬菌体感染细菌后，并不一定使细胞死亡，故这类噬菌体称为温和噬菌体。λ噬菌体就是一种温和噬菌体，感染大肠杆菌后能经历溶源性或裂解性两种生长途径。当λ噬菌体感染宿主菌时，噬菌体附着在细胞表面，将它的DNA注入细胞，外壳蛋白则留在外面。在进行溶源性生长时，λ噬菌体将其自身的DNA整合进细菌的染色体DNA中，随细菌染色体DNA复制并传递给后代，这个稳定潜伏在细菌染色体DNA中的整套λDNA称为原噬菌体（prophage），含有原噬菌体的细菌称为溶源性细菌（lysogenic baclerium）。溶源性细菌不会产生子噬菌体颗粒，也不会裂解。原噬菌体经历一段较长的潜伏期后，当受到物理或化学因素的刺激时溶源周期终止而引发裂解。进入裂解性生长途径时，由于受到外界因素的刺激，宿主菌染色体DNA受到损伤，λDNA便从染色体DNA中分离出来，在宿主细胞内经过复制和重新包装后形成新的噬菌体颗粒，宿主细胞就会因原噬菌体的增殖而裂解死亡，释放出大量子代噬菌体颗粒。

噬菌体效价（Plague forming unit，PFU），是指单位体积（mL）噬菌体裂解液感染宿主菌后所形成的噬菌斑数目。这是衡量噬菌体活力的重要指标。噬菌体效价测定的方法一般采用双层琼脂平板法。把噬菌体原液做适当稀释并与一定量的宿主菌混合感染，然后加入融化的软琼脂培养基，混合后平铺于LB固体平板培养基上并于37℃条件下过夜培养。根据每一个平板上形成的噬菌斑数目、稀释液的体积和稀释倍数可得出被测噬菌体原液的效价。双层琼脂平板法所形成的噬菌斑（图11-1），在其形态、大小上比较一致，且清晰度较高，计数比较准确，因而被广泛应用。

图11-1　双层琼脂平板上的噬菌斑

实验用品

1.材料

λ噬菌体（λphage），大肠杆菌（E.coli）ER-1647。

2.试剂与培养基

（1）无菌蒸馏水。

（2）三氯甲烷（氯仿）。

（3）5mol/LNaOH溶液。

（4）1mol/LHCl溶液。

（5）λ噬菌体悬浮液（SM）：称取5.8g NaCl 和2g MgSO4·7H2O溶于800mL蒸馏水中，再加入50mL1mol/LTris-HCl（pH7.5，见附录八）和5mL2%明胶溶液，蒸馏水定容至1 000mL，灭菌。

（6）1mol/L硫酸镁贮备液：称取24.67g MgSO4·7H2O溶于100mL蒸馏水中，灭菌。

（7）20%麦芽糖贮备液：称取20g麦芽糖溶于100mL蒸馏水，用无菌0.22μm滤膜过滤灭菌，4℃保存。

（8）12mg/mL四环素贮备液（Tet.）：称取0.12g四环素溶于10mL无菌蒸馏水，用无菌0.22μm滤膜过滤灭菌，分装于无菌离心管，-20℃保存。

（9）LB液体培养基：称取10g蛋白胨、5g酵母浸膏、10g NaCl溶于1 000mL蒸馏水，pH7.2，灭菌。

（10）LB软琼脂培养基：于LB液体培养基中加入0.7%琼脂粉，灭菌。

（11）LB固体平板培养基：于LB液体培养基中加入1.5%琼脂粉，灭菌。

3.器具

超净工作台、恒温振荡器、恒温培养箱、恒温水浴锅、离心机、电子天平、722分光光度计、加样枪、无菌培养皿（φ90mm）、无菌带盖玻璃试管（φ15mm×100mm）、无菌1.5mL离心管、无菌枪头（0.2mL，1mL）、三角瓶（50mL，100mL）、离心管盒、试管架、镊子、酒精灯等。

实验操作程序

1.受体菌活化

挑取一环受体菌（E.coli ER1647），接种于含四环素（终浓度12μg/mL）的10mLLB液体培养基中，置于30℃恒温振荡器内在250r/min条件下过夜培养，使受体菌活化。

2.受体菌培养

取10mLLB 培养液一瓶，加入20%麦芽糖和1mol/L硫酸镁各100μL，然后加入过夜培养的受体菌液100μL并混合。于37℃恒温振荡器（250r/min）内培养5～6h，当测OD600为1.0～1.5时，于4℃冰箱保存备用（1周内有效）。

在过夜培养中，于30℃培养将使细胞不易长至饱和状态，培养基中细胞碎片的量也保持在最低。如果把噬菌体加入饱和培养物中，会吸附于细胞碎片上而导致无效感染。

麦芽糖可诱导细胞膜上麦芽糖外膜蛋白受体（特异的噬菌体受体）的产生，使大肠杆菌更具有敏感性，利于噬菌体的结合和吸附，该受体的合成受麦芽糖的诱导却被葡萄糖所抑制。Mg2+的存在能促进噬菌体和受体菌的吸附作用。

3.预热平衡

将配制好的LB软琼脂培养基在沸水浴中融化，待降温后添加终浓度为10mmol/L的硫酸镁（50mL软琼脂中加500μL），然后在48℃恒温水浴中平衡1～2h备用。同时将LB固体平板培养基置于37℃恒温培养箱内预热平衡1～2h备用。

4.稀释裂解液(www.daowen.com)

在超净工作台上，取6支干净无菌的1.5mL离心管并编号，每管各加入0.9mLλ噬菌体悬浮液（SM）或LB培养液。另取1支λ噬菌体原液，吸取0.1mL加入1号管中混合均匀，再从1号管（10-1）中吸取0.1mL加入2号管中混匀，依此类推，按10倍梯度稀释至10-6。

5.感染吸附

取10支无菌带盖试管编号，按下表（表11-1）所示分别加入相应组分，混合后置于37℃恒温振荡器内，在150r/min条件下振荡培养30min。让噬菌体颗粒充分吸附并侵入受体菌细胞。

表11-1　λ噬菌体感染取样表

6.双层培养

于上述每支试管中加入3～4mL预平衡的软琼脂培养基，迅速混匀后，立即倒入预平衡的、具有相应编号的LB固体平板中央表面，边倒入边轻轻旋转平板，使软琼脂均匀地分布于平板表面。室温下水平静置10min使之凝固，最后倒置于37℃恒温培养箱过夜培养。

如果在室温条件下培养，λ噬菌体DNA的注入及其在随后裂解周期中的一些活动将难以有效地进行，因而不能形成噬菌斑，除非室温超过28℃。

7.观察统计

次日观察，可以看到部分长满菌苔的平板上出现透亮的噬菌斑。观察并统计噬菌斑的数目，记录于下表（表11-2）。

表11-2　λ噬菌体效价测定记录表

8.收集裂解液

选择1～2个噬菌斑清晰、数目多的培养皿，加入10mL噬菌体悬浮液（SM），室温下50r/min振摇2h。然后收集裂解液于无菌离心管中，加入1～2滴氯仿后振荡混合，于4℃条件下保存。使用前离心，取用上清液。

对大多数噬菌体而言，在含有少量氯仿（约0.3%，V/V）的SM液中于4℃条件下保存是十分稳定的。

预期实验结果与分析

选取30～300个噬菌斑数的平板，按下式计算该噬菌体每mL原液的效价：

噬菌体效价（PFUs/mL）=噬菌斑平均数×稀释倍数×取样量（折算成1mL）

未感染噬菌体的平板（1号）应形成一片光滑的菌苔。噬菌体原液的稀释倍数越小，平板中噬菌斑越密集甚至连成片，无法计数；可选择稀释倍数高的10-5或10-6平板统计噬菌斑的数目，取平均值计算效价。

要点及注意事项

1.在稀释和感染操作过程中，加样量要准确，并注意更换枪头。

2.软琼脂培养基每次加入试管后应置于水浴锅保温，防止凝固。

3.平铺上层软琼脂培养基的过程中，动作要快并防止污染。

4.SM液中加入明胶的目的是有助于稳定噬菌体颗粒。

作业与思考题

1.根据统计结果计算λ噬菌体的效价（表11-2）。

2.要提高噬菌体效价测定的准确性，应注意哪些操作？

3.在受体菌活化过程中，加入麦芽糖和硫酸镁有何作用？

4.噬菌斑的大小是由什么因素决定的？

参考文献

1.乔守怡.遗传学分析实验教程［M］.北京：高等教育出版社，2008.

2.王金发，戚康标，何炎明.遗传学实验教程［M］.北京：高等教育出版社，2008.

3.沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验［M］.3版.北京：高等教育出版社，1999.

4.Sambrook J， Russell D.W.分子克隆实验指南［M］.3版.黄培堂等，译.北京：科学出版社，2002.

5.赵寿元，乔守怡，现代遗传学［M］.2版.北京：高等教育出版社，2008.

（牛炳韬）