实验目的

1.了解自发突变和紫外线诱变的原理。

2.掌握物理因子诱发微生物突变和筛选突变株的基本技术。

实验原理

在生物进化过程中基因突变是普遍存在的现象。基因突变有自发突变和诱发突变两种情况，自发突变是生命体在自然生长发育过程中自发产生的，特点是发生的频率低，是生物进化的主要因素；而诱发突变则是人为有目的地使用诱变剂处理而获得的突变，其目的是提高突变发生的频率，以加快获取有用突变体的速度。1927年，美国遗传学家Muller用X射线处理果蝇精子，证明基因突变可以诱发产生，从此开始了人工诱变研究的历史。许多物理因素、化学因素和生物因素对微生物都有诱变作用，这些能诱发突变的因素称为诱变剂。

紫外线（ultraviolet lite，UV）是一种常用的诱变剂，其最佳诱变波长在260nm左右。紫外线诱变的剂量与紫外灯管的功率、照射时间以及照射距离有关，实践中经常通过改变照射时间来改变照射剂量。适量的紫外线照射，可使微生物的核酸物质DNA的结构发生改变。诱变的主要作用是使细菌DNA双链之间或同一条链中相邻的2个胸腺嘧啶形成二聚体，并阻碍双链的解开和复制以及碱基间的正常配对，从而引起基因突变，最终导致表型的变化。受紫外线损伤的DNA能被可见光复活，因此，经诱变处理过的微生物样品需用黑纸或黑布包裹以避免可见光的照射。另外，照射处理后的菌液不能储放太久，以免突变在黑暗中修复。由于照射致死率在95%～99%时，回复突变株的出现率最高，因此实践中多采用60%～80%的致死率进行诱变。

本实验以紫外线为单因子诱变剂，对产生淀粉酶的枯草芽孢杆菌进行诱变处理，根据试验菌株诱变后在淀粉培养基上形成的透明圈直径的大小，确定其诱变效果。一般来说，透明圈直径越大，产生淀粉酶的能力越强。

实验用品

1.材料

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BF7658。

2.试剂

（1）0.9%无菌生理盐水。

（2）碘液：碘化钾2.0g溶于10mL蒸馏水中，加入碘1.0g，溶解后加水至300mL。

（3）营养肉汤液体培养基（NA培养基）：蛋白胨5.0g，牛肉浸膏3.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水定容至1 000mL，pH7.0。灭菌。

（4）淀粉固体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉浸膏5.0g，氯化钠5.0g，可溶性淀粉2.0g，琼脂15.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH7.0。灭菌。

3.器具

紫外照射箱、恒温培养箱、台式离心机、磁力搅拌器、移液器、无菌离心管（10mL）、无菌培养皿（φ9cm，φ6cm）、无菌涂棒、无菌玻璃珠、无菌搅拌棒、无菌三角瓶（50mL）、酒精灯、记号笔、黑纸、试管架、无菌吸头等。

实验操作程序

1.菌种活化培养

把枯草芽孢杆菌（BF7658）菌株接种到含有5mLNA培养基的三角瓶中，置于37℃、200r/min振荡培养过夜（14～18h）。培养至对数生长期，菌液浓度达到108～1010。

2.菌悬液制备

将三角瓶中的菌液转入无菌离心管中，在3 500r/min离心10min。弃上清液，加入5mL无菌生理盐水洗涤沉淀，转入50mL三角瓶，用无菌玻璃珠打匀沉淀制成菌悬液，待用。

3.诱变处理

（1）先打开紫外灯（功率为15W），预热15min，使光波稳定。

（2）分别取菌悬液3mL加入3套无菌培养皿（φ6cm）内，各放入无菌搅拌棒。

（3）将上述培养皿放在磁力搅拌器上，启动搅拌后在距离紫外灯30cm处进行照射。

（4）先在紫外灯下灭菌1min，再打开皿盖进行紫外处理。3个培养皿分别在照射45s、90s和180s时盖上培养皿盖，然后关掉紫外灯。紫外处理、稀释和涂布都需在红光下进行。

4.稀释(www.daowen.com)

将经紫外线照射处理的菌悬液用无菌生理盐水按10倍梯度稀释至10-6。

5.涂布

分别取10-4～10-6的稀释液各0.1mL，加到淀粉培养基平板中，用无菌涂棒涂布均匀，每个稀释度各涂2个平板。同时取未经紫外处理的菌悬液做同样稀释后，涂布两个平板作为对照。将平皿用黑纸包好，置37℃暗培养，24h后观察并记录结果。

6.观察诱变效应

取出平皿，分别向菌落分散开的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，确定诱变效应，把透明圈明显大于对照的菌落接种到斜面培养基培养保存。

7.计算存活率及致死率

存活率（%）=处理后每毫升活菌数/对照每毫升活菌数×100%

致死率（%）=1-存活率（%）

预期实验结果与分析

1.将紫外线诱变的实验结果填入表10-1中：

表10-1　紫外辐射对枯草芽孢杆菌的致死效应

2．观察诱变效应，将结果填入表10-2中：

表10-2　枯草芽孢杆菌诱变后的HC值比较

要点及注意事项

1.菌悬液使用之前务必摇匀。

2.紫外线照射计时应从打开培养皿盖开始。

3.紫外线照射操作应先启动磁力搅拌器，再打开培养皿盖。操作者应戴上墨镜和手套，避免紫外线伤害眼睛和皮肤。

4.由于紫外诱变引起的DNA结构变化有光复活作用，所以紫外线照射后的稀释、涂布等操作均应在红灯下进行，直至将平板用黑布或黑纸包裹好。

作业与思考题

1.紫外线诱变作用的机理是什么？

2.为保证诱变效果，在照射中和照射后的操作应注意哪些问题？

参考文献

1.王建波，方呈祥.遗传学实验教程［M］.武汉：武汉大学出版社，2004.

2.王金发，戚康标，何炎明.遗传学实验教程［M］.北京：高等教育出版社，2008.

（陆卫）