实验目的

1.了解大肠杆菌遗传转化的原理和用途。

2.掌握利用质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞的操作方法。

实验原理

转化（transformation）是细菌细胞摄取周围游离的外源DNA片段，通过染色体同源区段的交换而实现基因重组的过程。所以转化也是细菌传递DNA而实现基因重组的途径之一。转化时受体菌吸收外源DNA并整合于自身的基因组，进而引起受体菌发生某些遗传结构的改变。通过转化获得的转化细胞称为转化子（transformant）。转化技术提供了一种进行遗传分析的有效手段，也是进行分子生物学研究的一种重要基础手段。

外源DNA转化细菌的技术关键在于感受态细胞的制备过程。受体细菌经过某些特殊处理（如CaCl2、RuCl等试剂，低温等）后，细胞膜的通透性发生变化，可以容许外源DNA分子通过。人们把细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这种能接受外源DNA分子并被转化的细菌细胞称为感受态细胞（competent recipient cell），而促进转化作用的酶或蛋白质分子称为感受态因子。处于感受态和非感受态的细菌细胞都可以吸附DNA，但只有处于感受态的细菌所吸附的DNA才是稳定的，不易被洗脱掉。转化时供体DNA片段平均长度约为20 000个核苷酸对，DNA片段进入受体细胞后和受体染色体形成部分二倍体，因此有可能发生重组，从而使受体细胞发生稳定的遗传转化。外源DNA的转化过程包括以下几个连续的阶段：

（1）双链DNA分子和细胞表面受体部位进行可逆性结合。

（2）供体DNA片断被吸附进入受体细胞，并要防止受体DNA酶的破坏。

（3）供体DNA分子从双链解螺旋为单链，其中一条单链被降解。

（4）未被降解的单链DNA部分或整个插入受体细胞DNA链中，与同源区段形成杂合DNA分子（异源双链区）。外源DNA转化的最终结果取决于这段异源双链区中误配核苷酸对的修复校正。如果切除供体单链，则无重组发生；如切除受体单链则产生重组体。

（5）如无修复校正发生，则该细菌经DNA复制和细胞分裂，会产生一个有受体基因型的细胞和一个有重组体基因型的细胞，从而导致形成各种类型的转化子。

从一个供体菌分离出的DNA与另一受体菌活细胞接触，大约只有1%的受体细胞可吸附外源DNA，从而发生遗传转化，转化频率较低。可能的原因是只在受体细胞特定区域形成数目有限的临时性通道，另外还需酶、蛋白质分子以及能量等的协同作用。

处于对数生长早中期的大肠杆菌细胞，先用一定浓度的CaCl2溶液低温、低渗处理，再经短期的热休克（42～43.5℃）处理，使其成为易于吸收外源DNA的感受态细胞。外源DNA进入感受态细胞后，可在宿主细胞中复制与表达。本实验所用的pOK12载体质粒携带Kan抗性基因，因此，吸附了质粒DNA的细菌可在含Kan的培养基上生长，而不含质粒的细菌不能生长。这样在加入Kan的培养基中就可以筛选出转化子。

实验用品

1.材料

受体菌：大肠杆菌（E.coli）DH5α。

质粒DNA：pOK12。

2.试剂及培养基

（1）无菌去离子水。

（2）无菌100mmol/LCaCl2溶液（去离子水配制）。

（3）50mg/mL卡那霉素（Kan）：溶于无菌水，0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃保存。

（4）SOB培养液：蛋白胨20.0g，酵母粉5.0g，NaCl 5.0g，250mmol/LKCl 10.0mL，2mmol/LMgCl2 5.0mL，去离子水定容至1 000mL，pH7.0，灭菌，-20℃保存。

（5）SOC培养液：SOB培养液中加入终浓度为20mmol/L的葡萄糖，灭菌。

（6）LB液体培养基：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水定容至1 000mL，pH7.2，灭菌。

（7）LB固体培养基：LB液体培养基中加入1.5%的琼脂粉，灭菌。

（8）含Kan的LB固体培养基：LB固体培养基灭菌后，在倒平板之前加入终浓度为25μg/mL的Kan。

（9）无菌甘油。

3.器具

恒温培养箱、恒温水浴锅、分光光度计、离心机、制冰机、无菌培养皿（φ90mm）、无菌1.5mL离心管、无菌离心管（10mL）、无菌吸水纸、三角瓶、烧杯、广口瓶、镊子、离心管盒、酒精灯等。

实验操作程序

1.感受态细胞的制备

（1）在无菌条件下，从低温保存的受体菌（E.coli DH5α）平板上挑取一个单菌落接种于5mLSOB液体培养基中，于37℃，250r/min振荡培养过夜。

（2）取0.5mL过夜培养物接种到50mLSOB液体培养基中，于37℃，250r/min振荡培养2.5～3h。当测定OD600≈0.4时停止培养，此时细菌处于对数生长早期。

（3）将菌液分装至预冷的10mL无菌离心管中，冰浴静置10min。

（4）冷却的菌液经4℃，3 000r/min离心10min。

（5）弃上清液后，离心管倒置于无菌吸水纸上1min，吸尽残余培养液。(www.daowen.com)

（6）加入1mL预冷的100mmol/LCaCl2溶液，悬浮沉淀，制成菌悬液，冰浴10min。

（7）再经4℃，3 000r/min离心10min。

（8）弃上清液，同样将离心管倒置于无菌纸上1min，吸尽残余液。

（9）再加入1mL预冷的CaCl2溶液，重新制成菌悬液，即为感受态细胞。

（10）将菌悬液按每管200μL分装于无菌的1.5mL离心管中，用于转化的感受态细胞置于冰水中备用，剩余的菌液加入无菌甘油（终体积比为20%～30%），置于-80℃超低温冰箱保存。

2.质粒DNA的转化

（1）取三个干净无菌的1.5mL离心管预冷，编号。按表9-1加入各组分，混匀。

表9-1　大肠杆菌转化加样表

（2）将3个离心管于冰水中放置30min。

（3）将冰浴中的样品管在42℃水浴中准确静置90s（热休克），然后迅速放回冰水中，静置1～2min。

（4）无菌条件下在每支离心管中加入800μLSOC培养液，混匀后把所有样品小心地转入无菌离心管中，置于37℃振动45min。

（5）各取200μL培养物，分别均匀涂布在含25μg/mLKan的LB固体培养基上，同时各取200μL涂布在不含Kan的LB平板作为对照。每个平板做好标记。

（6）室温下放置10min，将平板倒置于37℃培养过夜，时间不超过20h。

（7）观察转化和对照平板中菌落的生长情况。

预期实验结果与分析

将观察结果填入表9-2中，并根据下式计算转化频率：

转化频率（%）＝转化子总数/DNA量（ng）×100%

表9-2　大肠杆菌质粒DNA转化结果统计

要点及注意事项

1.制备感受态细胞过程要严格无菌操作，细胞要尽可能保持在低温状态下。

2.质粒DNA样品体积不宜超过感受态细胞的5%，100mL感受态细胞需50 ng DNA。

3.转化时在37℃振动45min，目的是让抗生素抗性基因得到表达。

4.涂布细胞时浓度不宜太高，以每个培养皿中出现的菌落数不超过104个为宜。细胞密度过高或培养时间过长，都可能导致对抗生素敏感的菌落出现，反而对实验结果产生不利的影响。

作业与思考题

1.统计本次实验的转化子数，计算转化率，完成表9-2。

2.试述影响细胞转化效果的因素主要有哪些。

3.制备感受态细胞的过程，为什么要求细胞尽量保持在低温下进行操作?

参考文献

1.王建波，方呈祥.遗传学实验教程［M］.武汉：武汉大学出版社，2004.

2.王金发，戚康标，何炎明.遗传学实验教程［M］.北京：高等教育出版社，2008.

3.卢龙斗，常重杰.遗传学实验技术［M］.北京：科学出版社，2007.

（陆卫）