实验目的

1.了解细菌杂交的原理。

2.掌握利用梯度转移法进行基因定位的基本方法。

实验原理

1964年，E.L.Tatum和Lederberg发现了不同品系大肠杆菌之间的杂交现象，1968年，W.Hayes研究发现大肠杆菌具有性别分化现象。这些研究结果奠定了细菌遗传分析和基因定位的实验基础。细菌的基因重组是指细菌细胞接合后随之发生遗传物质交换和杂种细菌分离的过程。大肠杆菌染色体呈环状（图8-1）。带有F因子的大肠杆菌菌株（F＋菌株）能够与不带F因子的菌株（F－菌株）进行杂交进而发生基因重组。F因子一般游离于细菌染色体之外，也可能整合到细菌染色体上而形成高频重组菌株（Hfr菌株），F＋菌株和F－菌株杂交时发生基因重组的频率约为10-7，而Hfr品系和F－菌株杂交时发生重组的频率为10-4。当Hfr细菌与F－细菌细胞发生接合（即杂交）时，供体菌Hfr细胞的染色体转移到F－细胞内。由于染色体的转移具有一定的方向性，并且可以随时中断，因此根据接合后F－细菌（以重组子形式选出）中Hfr细菌染色体基因出现时间的先后顺序，即可得知基因转移的先后顺序。

图8-1　大肠杆菌连锁基因图

在杂交过程中，接合细菌可以在2小时中缓慢地进行遗传物质的传递。在杂交不同时间进行强力搅拌，打断接合细菌之间的接合管，从而终止遗传物质的转移。所以对应于转移起点越近的基因进入受体菌的几率越大，因此可以通过绘制基因的转移曲线推断出基因顺序并以时间为单位进行染色体作图，这种方法就是中断杂交作图。

本实验采用的是非中断杂交，不同的高频重组品系（Hfr）中F因子与主染色体的整合位置是不同的。Hfr菌株与F－菌株进行接合，染色体由Hfr向F－转移。由于染色体的转移是单方向性的，染色体上的基因都是连锁的，所以，靠近Hfr染色体转移起点的基因将有更多的机会出现在F－中，越是后端的基因出现的机会就越少。因此，根据细菌接合后F－菌中Hfr上的基因出现的多少就可以测定基因间的相对位置。

基因定位时首先要从Hfr与F－细菌的混合培养物中筛选出某一Hfr与F－细菌基因（选择性标记基因）已经发生了重组的细菌（重组子），然后在这些重组子中逐个测定其他的Hfr基因（非选择标记）出现的频率。Hfr菌株染色体上的选择性标记应位于染色体前端，这样才能保证以100%的频率出现在重组子中。选择性标记之后的基因，则以低于100%的频率出现在重组子中。F－细胞的选择性标记应起到排除Hfr菌生长的作用（即反选择）。本实验使用的F－菌株为Strr，Hfr菌为Strs，借此可排除Hfr菌的生长。另一方面为保证Hfr基因有机会出现在重组子中，反选择性标记应位于染色体后端。为了使Hfr菌株有较高的接合频率，F－细菌应该过量以保证每一个Hfr细菌都能与F－细菌接合。

实验用品

1.材料

供体菌：大肠杆菌（E.coli）CSH60 Hfr strs。

受体菌：大肠杆菌（E.coli）57B F－缺陷型met-leu-trp-his-arg-lac-gal-ade-ilv-strr。

2.试剂

（1）0.9%生理盐水，灭菌。

（2）10×A缓冲液：K2HPO4 105g，KH2PO445.0g，（NH4）2SO4 10.0g，柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O）10.0g，蒸馏水定容至1 000mL，pH7.0。

（3）LB液体培养基：蛋白胨10g、酵母浸膏5g、氯化钠10g，分别溶于1 000mL蒸馏水，pH7.2，灭菌。

（4）基本固体培养基：10×A缓冲液100mL，20%葡萄糖20mL，盐酸硫胺素4mL，0.25mol/LMgSO4·7H2O 4mL，琼脂17g，蒸馏水定容至1 000mL，pH7.0。葡萄糖在0.055 MPa（111℃）灭菌20min，其他成分在0.105 MPa（121℃）灭菌20min。

（5）选择固体培养基[A]～[G]：在基本固体培养基中按表8-1加入10mg/mL各种氨基酸各4mL。糖和氨基酸混合液在0.055 MPa（111℃）灭菌20min，其他成分在0.105 MPa（121℃）灭菌20min。在超净工作台上，待培养基降温至50℃左右时加入50mg/mL抗生素4mL，倒平板。

表8-1　选择培养基配方表

3.器具

无菌操作台、恒温培养箱、恒温振荡器、电子天平、高压灭菌锅、无菌培养皿、无菌150mL三角瓶、无菌牙签、无菌枪头（1mL，0.2mL）、无菌玻璃涂棒、50mL三角瓶、移液管、酸度计、微量加样枪、枪头盒、镊子、酒精灯、接种环、量筒等。

实验操作程序

1.菌种活化与培养

（1）分别接种一环供体菌和受体菌于5mLLB液体培养基中，在37℃，200r/min条件下振荡培养过夜（10～12h）。

（2）各取1mL过夜培养物，分别加入2瓶5mLLB培养液中，在37℃，200r/min继续振荡培养2～3h。

2.细菌接合杂交

吸取0.5mL供体菌和4.5mL受体菌，加入一个无菌的150mL三角瓶中混合，置于37℃，200r/min下振荡培养100min。

3.接合菌液稀释

将上述接合菌液用无菌生理盐水按10倍梯度稀释至10-2。

4.母平板制备

吸取10-1和10-2稀释液各0.1mL，涂布在选择培养基[A]平板上，每一稀释度涂布2个平板。同时将供体菌和受体菌原液分别吸取0.1mL，各涂布一个[A]平板作为对照，所有平板倒置于37℃恒温培养箱，培养24～48h。(www.daowen.com)

5.方格式点种

（1）观察和计数选择培养基[A]平板上接合组和对照组的菌落生长状况。

（2）在与平皿相同大小的白纸上画100个小格，将纸片贴于选择培养基[B]～[G]平板的底部，然后用灭菌牙签从接合组选择培养基[A]平板上随机挑选100个菌落，对号点种在选择培养基[B]～[G]平板的100个小格中。

（3）将所有平板置于37℃培养24～48h。

6.观察计数

统计在各种选择培养基平板上生长菌落的数目。

预期实验结果与分析

1.实验结果

将统计结果记录于表8-2中。根据统计结果，将大肠杆菌的几个连锁基因作出线性排列的位置顺序，并绘制出基因顺序图。

表8-2　选择培养基上生长的菌落数目统计

*重组率（%）=每组选择性培养基菌落数/点种菌落总数×100%

2.计算基因间的图距

由于图距与重组率的倒数有较好的线性相关关系，所以可用重组率的倒数作为图距。

3.绘制大肠杆菌基因连锁图

图8-1和图8-2是大肠杆菌基因连锁图，供计算时参考。

图8-2　大肠杆菌的遗传图示

要点及注意事项

1.配置培养基等准备工作是最简单的，但也是最重要的，因为一旦培养基出错，后续结果就无任何意义了。

2.杂交，涂A板要求无菌操作，操作中要注意“有菌的不碰无菌的，无菌的也不要碰无菌的”。本实验由于培养基中含抗生素，所以无菌操作要求不是那么严格，但是作为对无菌操作的练习还是应该认真对待，操作过程有菌的东西都不要直接经过无菌的上方。

3.点菌时要注意牙签不要插得太深，否则计数时会搞不清是牙签印还是菌落。但是又要保证碰到，不然可能没有点上。一根牙签要点六块板，点到后三块时菌浓度肯定更低，所以要用牙签的另一面点菌。因为是统计数据，所以不需要太严格地一根牙签点六块板，但是从误差分析角度考虑，这样点误差要相对小一些。

4.统计的时候最好是两人各统计一遍，有疑问的时候讨论解决。一般的经验是，反面不确定就看正面、侧面，从多个角度观察，菌落会比较潮湿而且稍微高出培养基，可以和牙签印分开的；对于长了霉菌的也用这个方法，霉菌菌落的形态和大肠杆菌不同，仔细从不同角度观察可以判断霉菌菌落旁有没有盖着大肠杆菌菌落。

作业与思考题

1.如何证明细菌重组是由杂交产生的，而不是由回复突变产生的？

2.F+菌株和Hfr菌株分别与F－菌株杂交，产生重组频率不同的原因是什么？

3.在杂交实验中，为什么杂交液中受体菌的浓度要远大于供体菌的浓度？

参考文献

1.李雅轩，赵昕.遗传学综合实验［M］.北京：科学出版社，2006.

2.Leland H.Genetics: From Genes to Genomes［M］.4th edition.McGraw-Hill Education，2011.

3.张贵友.普通遗传学实验指导［M］.北京：清华大学出版社，2003.

（陆卫）