实验目的

1.学习并掌握果蝇同工酶实验技术。

2.学习同工酶实验结果的分析方法。

实验原理

酶是具有生物催化功能的蛋白质。同工酶（Isozyme）是指那些催化功能相同，但结构和理化性质却不同的一类蛋白分子。早在1957年，Markert和Moakash首次提出了同工酶分析技术。随着现代遗传学和分子遗传学的发展，同工酶分析技术已成为分子水平研究生物遗传现象的有效方法之一，已广泛应用于遗传多样性、基因作图、群体遗传进化、遗传育种、物种的分类鉴定、物种起源等多个领域。

酯酶（Esterase，Est）同工酶是催化羧酸酯水解的结构专一性酶，在果蝇体内含量丰富，性质稳定，易于分离，经特异性染色，显带清晰，且具有较好的重复性。Est同工酶表现为共显性性状，可能受单基因位点控制，也可能受多个基因位点控制，可以从酶谱中直接推知个体的基因型，并对基因进行遗传分析，因此在研究中被广泛应用。蛋白质分子的结构是由基因的分子结构决定的，因此酶蛋白分子不同，反映出编码基因的DNA碱基序列不同。同一生物在不同的发育时期，同工酶存在不同的蛋白分子形式，因此，取材的发育时期不同，酶带分布情况就不同。这为同工酶分析技术应用于发育研究提供了方便，但在利用该技术分析物种的遗传差异时，则特别要求取材时期的一致性，以便消除由于发育时期的不同而造成的偏差。

本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，利用不连续系统中的三种物理效应：电荷效应、分子筛效应和浓缩效应，将大小和分子构型不同的Est同工酶分离开，具有较高的分辨率。利用特异底物染色，使Est同工酶在凝胶上显示出迁移率不同的活性区带，可估算每条酶带的相对迁移率及相对分子质量，并对控制基因进行遗传分析。

本实验可以设计为探究性实验，通过比较不同品系果蝇的酯酶同工酶谱，研究种群的基因结构变化和种内、种间的亲缘关系，以及亲、子代间同工酶的遗传方式，还可以利用一定数量的实验个体进行群体遗传分析等。

实验用品

1.材料

黑腹果蝇（D.melanogaster）的不同品系或具有亲子代关系的若干个群体。

不同品系果蝇的具体性状为：

①野生型（+）：红眼、灰体、长翅；

②残翅（vg）：红眼、灰体、残翅；

③黑体（b）：红眼、黑体、长翅；

④三隐（w、m、sn）：白眼、小翅、焦刚毛。

2.试剂

（1）Tris-柠檬酸缓冲液：称取Tris 15.0g，柠檬酸1.25g，溶于蒸馏水中，定容至1 000mL，pH8.9。

（2）丙烯酰胺（Acry）溶液：称取Acry 24.0g，溶于Tris-柠檬酸缓冲液中，定容至100mL。

（3）甲叉双丙烯酰胺（Bis）溶液：称取Bis0.75g，溶于Tris-柠檬酸缓冲液，定容至100mL。

（4）乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）溶液：称取Na2EDTA 0.187g，溶于15mLTris-柠檬酸缓冲液中。

（5）过硫酸铵（AP）溶液：称取AP 0.4g，溶于10mL蒸馏水中。

（6）丙烯酰胺（Acry）-甲叉双丙烯酰胺（Bis）溶液：称取Acry 10.0g，Bis 2.5g，溶于蒸馏水中，定容至100mL。

（7）四甲基乙烯二胺（TEMED）原液。

（8）电泳缓冲液：称取Tris 6.2g，甘氨酸2.0g，溶于100mL蒸馏水中，pH8.7，使用时稀释50倍。

（9）样品提取液：称取蔗糖1.5g，Triton X-100 0.5g，溴酚蓝0.01g，溶于10mL蒸馏水中。

（10）磷酸盐缓冲液：称取Na2HPO4·12H2O 5.37g，NaH2PO4·2H2O 13.26g，溶于500mL蒸馏水中，pH6.4，使用时稀释2倍。

（11）染色液：称取α-醋酸萘酯、β-醋酸萘酯、坚牢蓝RR盐各100mg，溶于10mL丙酮中，再加入100mL磷酸盐缓冲液（pH6.4），过滤后使用。

（12）脱色固定液：水∶甲醇∶冰醋酸=5∶5∶1。

3.器具

高速台式冷冻离心机、电子天平、电泳仪、垂直电泳槽、凝胶成像系统、冰箱、0.2mL玻璃匀浆器、研磨棒、1.5mL离心管、微量进样器、吸管、果蝇培养瓶、毛笔、麻醉瓶、小镊子、瓷盘等。

实验操作程序

1.预培养

（1）将黑腹果蝇的不同品系接种培养，或将具有相对性状的雌雄果蝇单对杂交。培养1周后，将亲本转移至新培养瓶中，核对亲本性状并保存。

（2）新羽化的成虫转入新培养瓶中，继续培养2～3d后，可以进行单个制样。

2.凝胶制备

（1）分离胶的制备

安装垂直板电泳槽的2块玻璃板，底部用1%琼脂糖凝胶封好，然后按表4-1的配方配制分离胶溶液。混匀后，以注射器小心灌入模具，距离顶端1～2cm处停止灌胶，覆盖1～5mm的水层，隔离氧气并使胶面平整。约30min后分离胶聚合，在分离胶和水层之间可见一清晰的界面。

表4-1　分离胶组成液

（2）浓缩胶的制备

吸尽覆盖在分离胶上的水层。按表4-2配方配制浓缩胶，混匀，小心、迅速地注入，然后插入样品梳，约30min后，浓缩胶聚合。

表4-2　浓缩胶组成液(www.daowen.com)

将制好的凝胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液，轻轻拔出样品梳。

3.样品制备

（1）研磨制样

将记录了性状特征的单只果蝇，放入预冷的玻璃匀浆器中，加入约20μL预冷的样品提取液（按样品质量与样品提取液体积比1∶8），在冰浴中研磨成匀浆。

（2）离心

将研磨后的混合液转入1.5mL离心管中，在4℃，3 500r/min离心3min。冰箱保存，上清液用于电泳。

4.酯酶同工酶电泳

（1）加样

用微量进样器每孔加样10μL，缓慢注入，防止扩散。

（2）电泳

在4℃条件下，以300V稳压电泳，方向从负极到正极。当溴酚蓝进入分离胶后，电压升至450V，约2.5h后，溴酚蓝到达底部标线处，可停止电泳。

5.染色

取出凝胶板，小心剥离凝胶，放入染色液中，室温下约20min后，可见清晰的酯酶同工酶条带。

6.脱色固定

取出凝胶，用蒸馏水漂洗干净，置于脱色固定液中漂洗过夜，酶带更为清晰。凝胶晾干后可长久保存，或浸于水中，可供长期观察。

7.观测拍照

观测凝胶中不同样品酶带的条数、宽度、着色深浅以及特殊酶带等，用凝胶图像分析系统拍照，保存酶谱。

8.酶谱分析

对酶谱进行比较分析，测算相对迁移率（Rm）和相对分子质量（Mr），记录在表4-3。

表4-3　果蝇酯酶同工酶的相对迁移率（Rm）和相对分子质量（Mr）统计表

预期实验结果与分析

凝胶经脱色固定后，果蝇Est同工酶带呈现紫红色。对酶谱进行比较分析发现，不同品系果蝇Est同工酶的酶带、相对迁移率和相对分子质量都显示出某些共同之处，但又存在显著差异。酶带的不同对于分析种间差异非常有用，尤其对在形态上近似的种进行鉴别和分类时，Est同工酶可作为科学的鉴定指标之一。

同工酶属于共显性性状，可以从酶谱直接推知个体的基因型。同工酶有可能由单基因位点决定，也可能由多个基因位点决定，所以表现出的酶谱比较复杂。

要点及注意事项

1.丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等都是剧毒性药品，操作时应注意安全。

2.过硫酸铵溶液需新鲜配制，40%的过硫酸铵在冰箱只能储存2～3d，低浓度的过硫酸铵溶液只能当天使用。

3.Est同工酶带在蛹期和成虫刚羽化时都不显示，新羽化的成虫应培养2d以上再制样。

4.灌胶时一定要小心操作，不能产生气泡，以免电泳时影响电流通过。

5.如果需要分析不同个体的基因型，制备样品时必须单只果蝇制样。

作业与思考题

1.观测凝胶中不同样品的酶带，对凝胶扫描图谱进行比较分析，测算每条酶带的相对迁移率（Rm），并估算相对分子质量（Mr），填入表4-3中。

2.画出每个样品的酶谱及综合带谱的模式图。

3.进行亲子代酯酶同工酶遗传方式的研究。

参考文献

1.胡能书.同工酶技术原理及其应用［M］.长沙：湖南科学技术出版社，1985.

2.刘祖洞，江绍慧.遗传学实验［M］.2版.北京：高等教育出版社，1979.

3.耿星河，邓明文.黑腹果蝇几种不同品系的酯酶同工酶比较研究［J］.内蒙古师范大学学报：自然科学（汉文）版，2004，33（4），424-427.

4.李雅轩，赵昕.遗传学综合实验［M］.北京：科学出版社，2006.

（牛炳韬）