实验目的

1.掌握果蝇的杂交技术。

2.记录杂交结果和掌握统计分析方法。

3.验证并加深理解遗传分离定律。

实验原理

分离定律又称为孟德尔第一定律。控制相对性状的一对等位基因在杂合子中各自保持其独立性，在配子形成时，彼此分开，随机地进入不同的配子中。在正常情况下，F1杂合子的配子分离比为1∶1，F2代的基因型分离比是1∶2∶1。如果相对性状间呈完全显性关系，则具有一对相对性状差异的两纯合亲本杂交，F1杂合子表现显性性状，其测交子代（即F1杂合子与隐性纯合亲本回交的子代）和自交子代（F2）都只有显性和隐性两种表型，前者比例为1∶1；后者比例为3∶1。如果相对性状间呈不完全显性或并显性，则F1表现两亲本的中间性状，其测交和自交子代表型分离比就等同于基因型分离比。因此可以根据杂交的配子类型及比例、F1、F2以及测交子代群体表型类型与比例等对相对性状进行遗传分析。

野生型果蝇为红眼、灰身、长翅、直刚毛，与这些性状对应的突变性状很多，其中长翅（+）与残翅（vg）是一对相对性状，且长翅对残翅为完全显性，控制这对相对性状的基因位于第二号染色体（Ⅱ67.0）上。用具有这对相对性状的两纯合亲本进行杂交（表2-Ⅰ-1），性状的遗传行为应符合分离定律。

表2-Ⅰ-1　果蝇的单因子遗传分析（长翅-残翅）

实验用品

1.材料

黑腹果蝇的长翅品系（+∥+）、残翅品系（vg∥vg）。

2.试剂

乙醚、乙醇、丙酸、蒸馏水、琼脂粉、玉米粉、酵母粉、蔗糖、红糖。

3.器材

恒温培养箱、双目解剖镜、高压灭菌锅、电子天平、白瓷板、镊子、毛笔、解剖针、麻醉瓶、果蝇培养瓶（三角瓶和平底试管）、死蝇盛留器、海绵垫、脱脂棉、医用纱布、标签纸、牛皮纸、棉线、橡皮筋、酒精灯等。

实验操作程序

1.原种果蝇培养

于杂交实验开始前两周，20℃条件下分别培养长翅和残翅果蝇品系。待每个培养瓶幼虫化蛹之后，移去培养瓶中的成蝇，准备从羽化不超过12h的果蝇中挑选杂交亲本。

2.挑选杂交亲本果蝇

选长翅和残翅果蝇为亲本，做正交和反交组合。由于雌蝇生殖器官中有贮精囊，一次交配可保留大量精子，供多次排卵受精用，因此做杂交实验前必须收集未交配过的处女蝇。刚羽化的雌蝇在12h内一般无交配能力，因此在杂交实验开始前放出亲本培养瓶中的所有成蝇，然后每隔10～12h收集一次刚羽化出的成蝇，并将雌雄蝇分开饲养。收集处女蝇数量的多少根据需要而定，通常不少于5对。

3.麻醉接种

用长翅果蝇与残翅果蝇杂交，正反交同时进行。即长翅♀×残翅♂，残翅♀×长翅♂。将所选处女蝇按品系分别麻醉，按不同杂交组合分别选取雌、雄蝇各6～10只移入杂交瓶中，为了防止昏迷果蝇被培养基粘住，可将培养瓶放倒，将果蝇置于瓶壁，待其完全苏醒后再将培养瓶直立，贴上标签。标明杂交亲本、杂交日期、实验人姓名。将杂交瓶放在25℃恒温箱内培养。

4.去亲本

杂交培养7d后，亲本果蝇都已杂交产卵。在杂种幼虫化蛹羽化前，将亲本移出弃去，目的是防止亲本与F1代成蝇发生回交（移去的果蝇最好处死）。

5.观察杂种F1代

继续培养7d，F1代果蝇羽化为成虫后，经麻醉在白瓷板上用解剖镜观察和统计正反交F1代个体的性状，判断F1代个体的性状是否和预期结果一致。

6.培养杂交F2代

分别收集正反交F1代果蝇6～10对放入一新培养瓶，在25℃恒温箱内继续培养7d后，移去F1代果蝇。再培养7d，F2代成蝇出现，观察并统计F2代的性状表现类型及数目。并将观察结果填入表2-Ⅰ-2。(www.daowen.com)

7．统计检验

用χ2检验法对试验结果进行统计检验，验证分离定律。

表2-Ⅰ-2　正反交F1代和F2代果蝇翅型观察记录表

预期实验结果与分析

1.观察和统计正反交F1代果蝇的表型和个体数，并将正反交的结果加以比较，分析单因子杂交实验基因间的显隐性关系。

2.观察和统计正反交F2代果蝇的表型和个体数，计算不同表型之间的比例，根据实验观察和统计结果做χ2检验（表2-Ⅰ-3）。

表2-Ⅰ-3　实验结果χ2检验表

自由度（df）＝n-1χ2＝∑（O-E）2/E

在遗传实验中，实际观察值一般不会跟理论预期值完全一致。那么，实验观察值与理论预期值之间的偏差，到底是由随机误差造成的还是由非偶然因素造成的？这就需要运用生物统计学的方法加以检验。常用的一种检验方法称为χ2检验（Chi-square test），也称为适合度（goodness of fit）检验法。其计算公式为：

χ2＝∑（O-E）2/E

上式中O为实际观察数，E为理论预期数，Σ为各项总和。χ2的自由度df（即分离类型组数n减去1）＝n－1。根据自由度，可从χ2分布表查出χ2的概率范围。一般要求χ2的概率P＞0.05时，才可认为实验观察值与理论预期值相符，即它们之间的偏差属于随机误差。

查χ2表（df=2-1=1），若P＞0.05，表明实验观察数与预期数之间无显著性差异，说明两者之间的偏差是没有意义的，也就是说实验观察数符合理论假设；若P＜0.05，说明实验观察数与预期数差异显著，不符合理论假设。

孟德尔定律的普遍性和正确性毋庸置疑。如果实验观察数值与预期数值之间差异显著，通常可能是由下列原因造成的：

（1）培养密度过大，自然选择导致突变型个体生存不利，死亡率高于相应野生型。

（2）亲本移去不彻底，或在实验过程中有外来果蝇混入并参与交配。

（3）新羽化果蝇意外死亡，导致性状判断失误，影响实验观察数据。

（4）不同性状果蝇发育时间长短稍有不同，由于统计杂交数据时间短，导致实验数据出现偏差。

要点及注意事项

1．严格控制挑选处女蝇的时间，挑选的处女蝇最好单独培养2～3d，如果有幼虫出现，说明有非处女蝇混杂。

2.当发现培养瓶内有蛹出现后应及时将亲本移去并处死，以防发生回交或混杂。

3.观察和统计F1代、F2代果蝇时，先对果蝇进行深度麻醉，再进行观察统计。特别是观察翅型时，尽量避免果蝇死亡导致翅膀外展，干扰性状观察。

4.乙醚是神经麻醉剂，果蝇的麻醉操作应在有通风装置的实验室中进行。

作业与思考题

1.如果分别对F1代和F2代的雌雄果蝇进行统计分析，分离规律的验证结论有否不同？

2.纯合亲本杂交时需选择处女蝇，那么F1代雌雄个体间杂交产生F2代时是否还需要选择处女蝇？为什么？

3.正反交的实验结果必然相同吗？如果正反交结果不一致，可能的原因是什么？