由于各种细菌的新陈代谢类型不同，对不同物质利用后所产生的代谢产物有差异，所以常用生理生化反应来鉴别。在形态或其他方面不易区别的微生物，如肠道细菌中的大肠杆菌和伤寒杆菌，两者在形态上很难区分，但前者能发酵乳糖，后者不能，因此，可以从它们能否发酵乳糖来加以区别。

图17-26 液体培养特征

（一）接触酶试验

接触酶又称为过氧化氢（H₂O₂）酶，能催化H₂O₂分解为H₂O和O₂，是一种以正铁血红素作为辅基的酶，其反应式如下

本试验主要用于将乳酸菌和厌氧菌与其他细菌的区别，因为乳酸菌和厌氧菌不产生接触酶，因此接触酶的有无，是区别好氧菌和厌氧菌的方法之一。

1.试剂 体积分数为3%～10%的H₂O₂

2.培养基

（1）用普通牛肉膏蛋白胨培养基，但培养基中不能含有血红素或红细胞，以免产生假阳性结果。

（2）测定乳酸菌时，培养基中应加入质量分数为1%的葡萄糖，因为乳酸菌在无糖培养基上生长时，可能产生一种“假过氧化氢酶”的非血红素的过氧化氢酶。

3.操作步骤 接种供试菌，适温培养18～24h。将体积分数为3%～10%的H₂O₂滴于斜面菌苔上（或涂有菌苔的载玻片上），静置1～3min，如有气泡产生即为阳性，有接触酶。

（二）唯一碳源实验

1.原理 自然界含碳化合物种类繁多，细菌能否利用某些含碳化合物作为唯一碳源，可以作为分类鉴定的依据。在基础培养基中只添加一种有机碳源，接种后观察细菌能否生长，就可以判断该细菌能否以此碳源作为唯一碳源生长。

2.器材

（1）待测菌种。

（2）基础培养基：

（NH₄）₂SO₄ 2.0g MgSO₄·7H₂O 0.2g

NaH₂PO4·H₂O 0.5g CaCl₂·2H₂O 0.1g

K₂HPO₄ 0.5g 蒸馏水 1000mL

待测底物包括糖类、醇类、脂肪酸类、二羧酸类、有机酸类和氨基酸类等。一般底物要求过滤除菌，糖醇类质量分数为0.5%～1%，其余为0.1%～0.2%。

3.实验步骤

（1）菌悬液的制备 为了使接种量均一，可将待测菌先制成菌悬液，即取少量菌苔放入无菌水中，充分混匀即可。

（2）接种 以菌悬液接种，接种量0.2mL，连续接种三代。

（3）培养 根据测试微生物种类不同，提供合适的培养条件，细菌一般培养48h，培养后观察是否生长，生长者为阳性。

（三）葡萄糖氧化发酵试验

糖发酵产酸是细菌分类鉴定中的一项重要指标。细菌从糖类产酸并不都是发酵性产酸，有些细菌是以分子氧作为最终受氢体，但以O₂为最终受氢体的细菌产酸量较少，且常常被培养基中蛋白胨分解时所产生的氨中和，而表现不出酸性。为此，用低含量有机氮培养基来鉴别细菌从糖产酸是氧化性的还是发酵性的，一般以葡萄糖为代表，也可用该基础培养基测定细菌从其他糖或醇类产酸的特性，这一试验已广泛用于细菌分类鉴定。

1.培养基（休和利夫森二氏培养基）培养基配方如下：

蛋白胨2.0g NaCl 5.0g

K₂HPO₄ 0.2g 琼脂（水洗） 5～6g

溴麝香草酚蓝（溴百里酚蓝）水溶液（质量分数为1%） 3mL

蒸馏水 1000mL pH值 7.0～7.2

分装试管，培养基高度约为4～5cm，在121℃下灭菌20min。

使用时，将培养基在沸水中融化，无菌操作把经过灭菌的糖液加到试管中，使其质量分数达到1%，摇匀，冷却后备用，也可把质量分数为1%的葡萄糖直接加入培养基中，在132℃下灭菌20min。

溴麝香草酚蓝（质量分数为1%）：先用少量质量分数为95%的酒精溶解后，再加水配成质量分数为1%的水溶液。

2.操作步骤

（1）将培养18～24h的幼龄菌穿刺接种于上述培养基中，每株菌接4支。

（2）取其中2支，将灭菌的凡士林（可加一半液体石蜡混匀）注入试管（约0.5～1.0cm厚）以隔绝空气，另2支不封油，为开管，同时以不接种的开、闭管作对照，置于30℃下培养，在第1天、第2天、第4天、第7天、第14天各观察1次。

3.结果观察 氧化产酸——仅开管产酸变黄，而且培养基上层产酸变色部分不超过1cm，48h后，氧化作用强的菌也只有半管左右因产酸变色，氧化能力弱的菌往往在1～2天时，上部产碱变蓝，以后才稍因产酸而变黄。发酵产酸——开管及闭管均产酸，沿穿刺线先产酸变色，发酵作用强的菌培养24h内可因产酸而全管变色，如产气，则在琼脂柱内产生气泡。

（四）油脂水解试验

某些细菌产生脂肪酶，能将培养基中的脂肪分解为甘油和脂肪酸，产生的脂肪酸与中性红（pH值为6.8～8.0，由红变黄）结合形成红色斑点。

1.培养基 配方如下：

蛋白胨 10g NaCl 5g

牛肉膏 5g 香油或花生油 10g

琼脂 15～20g 蒸馏水 1000mL

pH值 7.2 中性红（质量分数为1.6%的水溶液）约1.0mL

在121℃下灭菌20min。配制时应注意，不能使用变质的油。油、琼脂和水先加热，调好pH值之后，再加入中性红使培养基稍呈红色为止。分装培养基时，需要不断地搅拌，使油脂均匀分布于培养基中。

2.操作步骤 将融化好的培养基冷却至50℃左右，充分振荡，再倒平板，用接种环挑取少量待测菌划线，如图17-27所示。30℃恒温培养2～5天。

3.结果观察 打开培养皿，其底层长菌的地方如出现红色斑点，即说明脂肪被水解，此反应为正反应。

（五）硝酸盐还原试验

1.实验原理 某些细菌具有硝酸还原酶，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮，当加入格里斯氏试剂后，亚硝酸盐与其中的醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，后者与α-萘胺结合成为红色的N-α-萘胺偶氮磺酸，此为阳性反应。

图17-27 油脂水解试验接种

亚硝酸和格里斯氏试剂的作用如下：

硝酸盐的存在与否可用二苯胺试剂检查，当向溶液加入1～2滴二苯胺试剂时，培养液若呈蓝色，则表示培养物中有硝酸盐和新生成的亚硝酸盐，但都已还原成其他产物，为硝酸盐还原阳性反应。

2.培养基 配方如下：

牛肉膏 3.0g 蛋白胨 5.0g

KNO₃ 1.0g 蒸馏水 1000mL

pH值 7.0～7.6

每试管分装4～5mL或更多一些，在121℃下灭菌20min。

3.试剂

（1）格里斯（Griess）试剂的配制

A液：对氨基苯磺酸 0.5g

稀醋酸（质量分数为10%左右） 150mL

B液： α-萘胺0.1g

蒸馏水 20mL

稀醋酸（质量分数为10%左右） 150mL

（2）二苯胺试剂的配制：取0.5g二苯胺溶于100mL H₂SO₄，并用20mL蒸馏水稀释，保存于棕色瓶中备用。

4.操作步骤

（1）将待测菌接种于培养液中，适温培养1天、3天、5天，每株菌做2～3个重复，另外留2管不接种作为对照。

（2）取两支干净的空试管或在比色瓷盘反应室中，放入少许培养液，再滴1滴格里斯氏试剂A液和B液，在对照管中同样加入A液、B液各1滴。

（3）结果观察。若溶液变为粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性；如无红色出现，则可加1～2滴二苯胺试剂，此时若变为蓝色，则为阴性反应，如不变为蓝色，则仍为阳性反应。

（六）柠檬酸盐利用试验

1.实验原理 细菌分解柠檬酸盐产生碱性化合物，使培养基由微酸变碱，若采用溴麝香草酚作指示剂，则由绿色变为深蓝色，若采用酚红指示剂（pH值为6.8～8.4，由黄变红），则培养基由淡红色变为玫瑰色。

2.培养基 配方如下：

（NH₄）H₂PO₄ 1g K₂HPO₄ 1g

NaCl 5g MgSO₄·7H₂O 0.2g

柠檬酸钠 2g 琼脂 15～20g

蒸馏水 1000mL

溴麝香草酚蓝（酒精液）质量分数为1%的溶液10mL（或质量分数为0.5%的酚红液3mL）

将上述各成分加热溶解后，调pH值为6.8，然后加入指示剂，摇匀、过滤、分装试管，灭菌后，摆成斜面。

3.操作步骤

（1）将待测菌在斜面上划线接种，于30～37℃恒温培养3～5天。

（2）培养基为碱性（指示剂变为深蓝色）者为阳性，否则为阴性。若指示剂为酚红，则培养基由原来的淡粉红色变为玫瑰红色，即为阳性。

（七）明胶液化试验

1.原理 明胶是一种具有在20℃或较低温度时，形成凝胶性质的动物蛋白质。某些细菌能分泌蛋白酶分解明胶，使其失去凝固性，而由原来的固态变为液态，即所谓的明胶液化，即使在20℃以下也不再凝固。因此，通过细菌能否使明胶液化可表示其有无分解蛋白质的能力。

明胶液化试验采用穿刺法进行。

2.培养基 配方如下：

牛肉膏 3g 蛋白胨 10g

NaCl 5g 明胶 120g

蒸馏水1000mL

配制时，先将水加热，接近沸腾时再加入其他药品和明胶，不断地搅拌（以防明胶沾底），待融化后停止加热。调节pH值为7.2～7.4，分装，在112℃下灭菌30min。(www.daowen.com)

3.操作步骤

（1）接种。将培养18～24h的待测菌穿刺接种于培养基中，同时作未接种对照管。

（2）培养。放20℃恒温箱中培养，若细菌在20℃下不生长，则应放在最适温度下培养。

4.结果观察 观察培养基有无液化情况及液化后的形状，因明胶在低于20℃时凝固，高于25℃时自行液化。若是在高于20℃下培养的细菌，应放在冰浴中观察，若明胶被细菌液化，即使在低温下明胶也不会再凝固。

（八）产硫化氢试验

1.原理 某些异养菌能分解含硫的有机物产生H₂S气体，H₂S遇金属盐类，如铅盐、铁盐等，可形成黑色的硫化铅（PbS）或硫化铁（FeS）的沉淀物，从而可断定H₂ S的产生与否。其测定方法有两种：一种是用含有柠檬酸铁胺的培养基穿刺培养，看是否有黑色沉淀；另一种是在盛有液体培养基的试管中接种菌以后，在试管棉塞下吊一片醋酸铅试纸，经培养后观察醋酸铅试纸是否变黑。

2.方法一

（1）培养基　配方如下：

蛋白胨20g　NaCl　5g

柠檬酸铁胺 0.5g 硫代硫酸钠 0.5g

琼脂 15～20g 蒸馏水 1000mL

pH值 7.2

先将琼脂蛋白胨融化，冷至60℃加入其他成分，分装试管，在112℃下灭菌15min，备用。

（2）操作步骤

1）取待测菌穿刺接种于培养基，适温培养。

2）培养3天、7天、14天，观察有无黑色沉淀产生，若变黑色则为阳性。

3.方法二 采用滤纸条，其反应如下：

CH₂SHCHN H₂COOH+H₂O→CH₃COCOOH+H₂S↑+NH₃

半胱氨酸

S+Pb（CH₃COO）₂→PbS↓+2CH₃COOH

醋酸铅 硫化铅（黑色）

（1）培养基的配方如下：

蛋白胨 10g 胱氨酸 0.1g

NaSO₄ 0.1g 蒸馏水 1000mL

pH值 7.0～7.4

每管分装4～5mL，在112℃下灭菌30min。

（2）醋酸铅滤纸条制备：将普通滤纸浸在质量分数为5%的醋酸铅溶液中浸透，纸条宽约0.5～1cm，取出晾干，加压灭菌后，在105℃下烘干备用。

（3）操作步骤

1）培养液接种后，用无菌镊子取一条醋酸铅滤纸条，借助棉塞悬挂于试管中培养液之上，下端接近液面，但不可触及液面。同时以不接种的空白及已知阴性反应的菌为对照，适温培养。硫化氢的产生如图17-28所示。

2）培养3天、7天、14天观察，纸条变黑者为阳性，不变者为阴性。

（九）氰化钾试验

KCN是呼吸链末端的阻断剂，在含有KCN的培养基中是否能生长，是鉴别肠杆菌中各属的常规实验项目。

图17-28 硫化氢的产生

1.培养基 配方如下：

蛋白胨 3g NaCl 15g

KH₂PO₄ 0.225g Na₂HPO₄·2H₂O 5.64g

蒸馏水 1000mL pH值 7.4～7.6

在121℃下灭菌20min，冷却后加的15mL质量分数为0.5%的KCN水溶液，无菌分装于灭菌小试管中各1.0mL，另有不加KCN的对照管。

2.操作步骤

（1）接种培养18～24h的待测菌于测定管和对照管中。

（2）37℃恒温培养1～2天，测定管中生长者为阳性；测定管中未生长，而对照管中生长者为阴性。

（3）若测定管和对照管中均未生长，说明培养基成分不合适，应另外选择合适的培养基测定。

（4）KCN为剧毒药品，试验完毕在各试管中加几粒FeSO₄和0.5mL质量分数为20%的KOH去毒后，再按常规洗涤。

（十）生长温度试验

温度作为重要的生态因子，直接影响微生物的生长繁殖。不同种的细菌对温度的反应各不一样，适宜条件下，细菌能够正常生长；反之生长受到抑制，或引起变异，甚至死亡。

细菌的生长需要有适宜的温度范围，有最低、最适、最高温度，按照细菌对温度的适应性可分为三种类型，如表16-7所示。

表16-7 细菌生长温度范围

为了更好地反映温度对细菌生长的影响，应选择最适当的培养基和培养方法。

1.培养基 一般采用牛肉膏蛋白胨培养液，调节pH值为7.2～7.4，在112℃下灭菌20min，静置后取上清液，分装于透明度较好的试管中，再高压灭菌一次。

2.操作步骤

（1）接种待测菌于培养液中，在适宜温度下培养18～24h，即成菌液。如用固体培养，则制成菌悬液。

（2）用直径约0.5mm的接种针蘸取菌液（接种针浸湿深度约为1.0～1.5cm，接种量力求一致）加入培养液中，并与对照管一起置于特制的试管架上，分别在0℃、8℃、20℃、28℃、37℃，甚至55～65℃恒温水浴中（水浴液面应高于培养物液面）培养2天、4天、7天观察；接近0℃的低温，则培养3天、7天和30天观察。

（3）与未接种的对照管比较，目测生长情况，如浑浊度、沉淀物、悬浮物（包括环状和膜等），一般以生长良好（++）、生长差（+）、可疑（±）、不生长（-）四级记载。

（十一）初始生长pH值试验

pH值直接影响细菌的酶活性，与温度一样，不同种类的细菌均有其最适的pH值，某种细菌在其他环境条件固定时，其生长的pH值范围也是固定的，故可作为一个鉴定指标。

1.培养基 配方如下：

葡萄糖 5.0g NaCl 0.2g

KH₂PO₄ 0.2g MgPO₄·7H₂O 0.2g

CaSO₄ 0.1g 酵母膏 10.0g

蒸馏水 1000mL

将各成分溶解后，分成若干份，用稀盐酸或稀氢氧化钠溶液，根据试验要求，调成各种不同的pH值，将pH值为4.0、4.5、5.0、6.0分别分装试管，在112℃下灭菌30min，灭菌后再分别抽样测pH值，以此pH值为准。

2.操作步骤 用培养24～48h的液体培养基的待测菌接种于上述培养基，适温培养3天和7天观察，根据各液体培养的浑浊情况，记录其生长的pH值范围。

试验介绍的培养基缓冲力不强，所以只适合于测定初始生长的pH值试验，若要检测菌的不同pH值培养基的生长情况，应该另外设计缓冲力强的培养基。

（十二）需氧性的测定

氧对细菌的生长繁殖及生理功能影响很大，根据细菌与氧的关系，可将其分为好氧菌、厌氧菌、兼性厌氧菌及微好氧菌等。

1.原理 氧对细菌生长繁殖影响的测定，一般采用深层琼脂法或琼脂穿刺法。

2.培养基

（1）配方A如下：

蛋白胨 10g 酵母膏 5g

葡萄糖 1g 琼脂 15～20g

蒸馏水 1000mL pH值 7.0

用试管分装，在121℃下灭菌20min。

（2）配方B如下：

酪素水解物 20g

NaCl 5.0g

甲醛次硫酸钠 1.0g

硫基醋酸钠 2g

琼脂 15～20g

蒸馏水 1000mL

pH值 7.2

3.操作步骤

（1）深层琼脂法。将培养基放在沸水浴锅中加热融化，冷却至50℃左右时，用接种环取少许菌体接入培养基内，轻轻摇动均匀，置于冷水中使培养基凝固，30℃恒温培养2～3天进行观察。

（2）琼脂穿刺法。将培养基融化并冷却到50℃左右，用接种针取少许菌体或用一小接种环（外径1.5mm）的营养肉汤培养物，穿刺接种，注意不要搅动培养基，然后使其凝固，30℃恒温培养3～7天，观察细菌生长情况及部位。

（3）结果观察。细菌与氧气的关系如图17-29所示。

专性好氧菌：只生长在培养基表面。

专性厌氧菌：只生长在培养基底部。

兼性厌氧菌：生长在培养基表面及整个深部。

图17-29 细菌与氧气的关系

微好氧菌：生长在培养基的中上部，约近表面4mm处。