1.原理 测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的是利用显微镜直接测定微生物总细胞数。

直接计数法适用于各种单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，则难以直接测定。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板，这两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察，而血球计数板较厚，不能使用油镜观察，计数板下部的细菌难以区分。

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽所构成的3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（如图17-17所示），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格（如图17-18所示）。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同的特点，即计数区都由400个小方格组成。

图17-17 血球计数板的构造

a）主视图（中间平台分为两半，各有一个计数区） b）俯视图

图17-18 另一种血球计数板的构造

计数区边长为1mm，则计数区的面积为1mm²，每个小方格的面积为1/400mm²，盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以计数区的体积为0.1mm³，每个小方格的体积为1/4000mm³。使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每1mL菌液（或每1g样品）中微生物细胞的数量。

已知：1mL=10mm×10mm×10mm=1000mm³

所以1mL体积应含有小方格数为1000mm³/（1/4000mm³）=4×10⁶个小方格，即系数K=4×10⁶。

因此，每1mL菌悬液中含有的细胞数=每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）

2.器材

（1）活材料：酿酒酵母斜面菌种或培养液。(www.daowen.com)

（2）器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。

3.方法

（1）视待测菌悬液浓度，加无菌水适量稀释，以每小格的菌数可数清楚为度。

（2）取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

（3）将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液，也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，注意不要使计数区两边平台上沾上菌悬液，然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。

（4）静置片刻，将血球计数板置于载物台上夹稳，先在低倍镜下观察到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。观察时应适当关小孔径光阑并减弱光照的强度。

（5）若计数区是由16个大方格组成的，则按对角线方位，计数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100个小格）中的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需计数中央1个大方格中的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

（6）对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小的一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2～3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每1mL（g）菌悬液中所含酵母菌细胞的数量。

（7）测数完毕后取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。

4.结果 将实验结果填入表17-5中。

表17-5 实验结果记录表