生化池中的微生物有细菌、霉菌、酵母菌、放线菌、原生动物、后生动物等，微生物的机体，尤其是细菌是无色透明的。在显微镜下微生物体与其背景反差小，不易看清微生物的形态和结构，若增加反差，微生物的形态就可看得清楚。通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，便于观察。微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成的，细菌等电点的pH值在2～5之间，在中性（pH值等于7）、碱性（pH值大于7）或偏酸性（pH值为6～7）的溶液中，细菌的等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故多用碱性染料染色。碱性染料有美蓝、甲基紫、结晶紫、龙胆紫、碱性品红、中性红、孔雀绿和番红等。

革兰氏染色法是细菌学中很重要的一种鉴别染色法，它可以将细菌区别为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。

（一）革兰氏染色

1.原理 细菌细胞经草酸铵结晶紫染及碘液媒染后，在细菌壁及细胞膜上结合了不溶于水的结晶紫-碘的大分子复合物。革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量高，分子交联度紧密，故用酒精脱色时，肽聚糖网孔会因脱水而收缩，将结晶紫-碘的复合物阻留在细胞壁上而使细胞呈蓝色，复染亦不上色。革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，肽聚糖含量低且结构松散，与酒精反应后肽聚糖不易收缩，同时其脂类含量多且位于外层，酒精易将细胞壁溶出较大的空洞或缝隙，结晶紫-碘的复合物易被溶出细胞壁，脱去初染颜色，从而被沙黄复染液染成红色。

2.仪器及材料

（1）显微镜、接种环、载波片、酒精灯、擦镜纸、吸水纸。

（2）草酸铵结晶紫染色液、碘液、质量分数为95%的酒精、沙黄复染液。

（3）菌种 大肠杆菌、枯草杆菌。

3.步骤

（1）细菌的单染色步骤。标片的制作应执行无菌操作，接种环取菌前应进行灭菌，接种环的灭菌如图17-11所示。

标片的制作及细菌染色操作过程如图17-12所示。

1）涂片。取干净的载玻片于实验台上，在正面边角作个记号，按无菌操作的方法取一小滴菌液于载玻片中央（如菌种在固体培养基上，则滴一滴无菌蒸馏水于载玻片的中央，从斜面挑取少量菌种与载玻片上的水滴混匀），在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面积不宜过大。

图17-11 接种环的灭菌

图17-12 标片的制作及细菌染色操作过程

2）干燥。最好在空气中自然晾干，为了加速干燥，可在微小火焰上方烘干，但不宜在高温下长时间烤干，否则急速失水会使菌体变形。

3）固定。将已干燥的涂片正面向上，在微小的火焰上通过2～3次，以载玻片与手接触感到稍微烫手即可，由于加热使蛋白质凝固而固着在载玻片上不易脱落，同时固定也可使标本容易着色。

4）染色。在载玻片上滴加染色液（石碳酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种），使染液铺盖涂有细菌的部位作用约1min。

5）水洗。倾去染液，斜置载玻片，在自来水龙头下或用洗瓶小股水流冲洗，避免直接冲在涂面上，直至流下的水呈无色为止。

6）吸干。将载玻片倾斜，用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，注意勿将细菌擦掉。

7）镜检。用显微镜观察，并用铅笔绘出细菌形态图。

（2）细菌的革兰氏染色步骤

1）取两种菌种，均以无菌操作，分别做涂片、干燥、固定。方法均与简单染色的相同。

2）用草酸铵结晶紫染液染1min，水洗。

3）加革氏碘液媒染1min，水洗。

4）斜置载玻片于一烧杯之上，滴加质量分数为95%的乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色即可，随即水洗。为了节约乙醇，可将乙醇滴在涂片上静置30～45s，水洗。

5）用沙黄复染液复染1min，水洗。

6）用吸水纸吸掉水滴，置标本片于显微镜下，先用低倍镜观察，发现目的物后用高倍镜观察，注意细菌细胞的颜色，绘出细菌的形态图并说明革兰氏染色的结果。

细菌的革兰氏染色操作步骤如图17-13所示。

图17-13 革兰氏染色操作步骤

染色关键：染色过程中必须严格掌握乙醇脱色程度，如果脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够，则阴性菌被误染为阳性菌。

4.结果记录 革兰氏染色结果记录表如表17-1所示。

表17-1 革兰氏染色结果记录表

（二）细菌的荚膜染色

1.原理 由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。

2.器材

（1）活材料：培养3～5天的胶质芽孢杆菌（俗称“钾细菌”）。该菌在甘露醇作碳源的培养基上生长时，产生丰厚的荚膜。

（2）染色液和试剂法染色液、用滤纸过滤后的绘图墨水、复红染色液、黑素、质量分数为6%的葡萄糖水溶液、质量分数为1%的甲基紫水溶液、甲醇、质量分数为20%的CuSO₄水溶液、香柏油、二甲苯。

（3）器材：载玻片、玻片搁架、擦镜纸、显微镜等。

3.方法 推荐以下四种染色法，其中湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜的细菌，如用相差显微镜观察则效果更佳。

（1）负染色法

1）制片。取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取少量菌体放入水滴中混匀并涂布。

2）干燥。将涂片放在空气中晾干或用电吹风吹干。

3）染色。在涂面上加复红染色液染色2～3min。

4）水洗。用水洗去复红染液。

5）干燥。将染色片放在空气中晾干或用电吹风吹干。

6）涂黑素。在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触色素，使黑素沿玻片边缘散开，然后向右拖展，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。

7）镜检。先用低倍镜，再用高倍镜观察。

结果：背景为灰色，菌体为红色，荚膜无色透明。

（2）湿墨水法

1）制菌液。加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。

2）加盖玻片。放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。

3）镜检。先用低倍镜，再用高倍镜观察。

结果：背景为灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。

（3）干墨水法

1）制菌液。加1滴质量分数为6%的葡萄糖液于洁净载玻片一端，挑少量胶质芽孢杆菌与其充分混合，再加1环墨水，充分混匀。

2）制片。左手执玻片，右手另拿一边缘光滑的载玻片，将载玻片的一边与菌液接触，使菌液沿玻片接触处散开，然后以30°角迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端，使菌液铺成一薄膜。

3）干燥。在空气中自然干燥。

4）固定。用甲醇浸没涂片，固定1min后立即倾去甲醇。

5）干燥。在酒精灯上方，用文火干燥。

6）染色。用甲基紫染1～2min。

7）水洗。用自来水轻洗，自然干燥。

8）镜检。先用低倍镜，再用高倍镜观察。

结果：背景为灰色，菌体为紫色，荚膜呈一清晰透明圈。

（4）Tyler法

1）涂片。按常规法涂片，可多挑些菌体与水充分混合，并将黏稠的菌液尽量涂开，但涂布的面积不宜过大。

2）干燥。在空气中自然干燥。

3）染色。用Tyler法染色液染5～7min。

4）脱色。用质量分数为20%的CuSO₄水溶液洗去结晶紫，脱色要适度（冲洗2遍），用吸水纸吸干，并立即加1～2滴香柏油于涂片处，以防止CuSO₄结晶的形成。

5）镜检。先用低倍镜，再用高倍镜观察，观察完毕后注意用二甲苯擦去镜头上的香柏油。

结果：背景为蓝紫色，菌体为紫色，荚膜无色或为浅紫色。(www.daowen.com)

4.结果 绘出胶质芽孢杆菌的形态图，并注明各部位的名称。

5.注意事项

（1）加盖玻片时不可有气泡，否则会影响观察。

（2）应用干墨水法时，涂片要放在火焰较高处用文火干燥，不可使载玻片发热。

（3）在采用Tyler法染色时，标本经染色后不可用水洗，必须用质量分数为20%的CuSO₄冲洗。

（三）细菌的芽孢染色

1.原理 细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。芽孢染色法就是根据芽孢难以染色，但一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的，所有芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色。当染芽孢时，菌体也会着色，然后水洗，芽孢染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。

2.器材

（1）活材料：培养18～36h的苏云金芽孢杆菌或者枯草杆菌。

（2）染色液和试剂：质量分数为5%的孔雀绿水溶液、质量分数为0.5%的番红水溶液。

（3）器材：小试管（75mm×10mm）、烧杯（300mL）、滴管、载环片搁架、接种环、擦镜纸、镊子、显微镜等。

3.方法

（1）改良的Schaeffer和Fulton氏染色法

1）制备菌液。加1～2滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2～3环的菌体于试管中并充分混匀，制成浓稠的菌液。

2）加染色液。加质量分数为5%的孔雀绿水溶液2～3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。

3）加热。将此试管浸于沸水浴（烧杯），加热15～20min。

4）涂片。用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂片，晾干。

5）固定。将涂片通过酒精灯火焰3次。

6）脱色。用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。

7）复染。加番红水溶液染色5min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。

8）镜检。先低倍，再高倍，最后用油镜观察。

结果：芽孢呈绿色，芽孢囊和菌体为红色。

（2）Schaeffer与Fulton氏染色法

1）涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄涂片。

2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过3次。

3）染色：加质量分数为5%的孔雀绿溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片放在铜板上，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸气时开始计算时间，约维持15～20min，加热过程中要随时交替添加染色液和蒸馏水，切勿让标本干涸（加热时温度不能太高）。

4）水洗：待载波片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。

5）复染：用番红水溶液染色5min。

6）水洗：晾干或吸干。

7）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察芽孢和菌体的形态。

结果：芽孢呈绿色，菌体为红色。

4.实验结果 绘出所用材料的芽孢和菌体的形态图。

5.注意事项

（1）供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使菌体既有大量芽孢而又未完全脱落。

（2）用改良法时，若欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次是从小试管中取染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。

（四）细菌的鞭毛染色

1.原理 细菌的鞭毛极细，直径一般为10～20nm，只有用电子显微镜才能观察到，但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色的方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。

2.器材

（1）活材料：培养12～16h的水稻黄单胞菌、黏质赛氏杆菌或荧光假单细胞菌斜面菌种。

（2）染色液和试剂：A液为硝酸银染色液，B液为染色液、香柏油和二甲苯。

（3）器材：载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、玻片搁架、镊子、接种环、显微镜。

3.方法

（1）镀银法染色

1）清洗载玻片。选择光滑无裂痕的载玻片，最好选用新的。为了避免载玻片相互重叠，应将其插在专用的金属架上，然后将载玻片置于洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸20min，取出稍冷后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡5～6天，使用前取出载玻片，用自来水冲去残液，再用蒸馏水冲洗，将水沥干后，放入质量分数为95%的乙醇中脱水。

2）菌液的制备及制片菌龄较老的细菌容易脱落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）连续移接3～5代，以增强细菌的运动力。最后一代菌种放在恒温箱中培养12～16h，然后用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环。将挑取的菌液移至盛有1～2mL无菌水的试管中，使菌液呈轻度浑浊，将该试管放在37℃恒温箱中静置10min（放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开，然后吸取少量菌液滴在洁净的载波片一端，立即将载玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。将涂片放在空气中自然干燥。

用于鞭毛染色的菌体也可用半固体培养基培养，方法是将质量分数为0.3%～0.4%的琼脂牛肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿中，待凝固后在平板中央点接活化了3～4代的细菌，恒温培养12～16h后，取扩散菌落的边缘制作涂片。

3）染色。操作步骤如下：

①滴加A液，染4～6min。

②用蒸馏水充分洗净A液。

③用B液冲去残液，再加B液于载玻片上，在酒精灯火焰上加热，约维持0.5～1min（加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使载玻片出现干涸区）。

④用蒸馏水洗，自然干燥。

4）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。

（2）改良Leifson染色法

1）清洗载玻片，方法同前。

2）配制染料：染料配好后要过滤15～20次后染色效果才好。

3）菌液的制备及涂片。

①菌液的制备方法同前。

②用记号笔在洁净的载玻片上划分3～4个相等的区域。

③放1滴菌液于第一个小区的一端，将载玻片倾斜，让菌液流向另一端，并用滤纸吸去多余的菌液。

④干燥：在空气中自然干燥。

4）染色。

①加染色液于第一区，使染料覆盖涂片，隔几分钟后再将染料加入第二区，依此类推（相隔时间可自行决定），其目的是确定最合适的染色时间，而且节约材料。

②水洗：在没有倾去染料的情况下，用蒸馏水轻轻地冲去染料，否则会增加背景的沉淀。

③干燥：自然干燥。

5）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察，观察时多找一些视野，不要企图在1～2个视野中就能看到细菌的鞭毛。

结果：菌体和鞭毛均被染成红色。

4.结果 绘出鞭毛菌的形态图。

5.注意事项

（1）镀银法染色比较容易掌握，但染色液必须每次现配现用，不能存放，比较麻烦。

（2）Leifson染色法受菌种、菌龄和室温等因素的影响，且染色液需经15～20次过滤，要掌握好染色条件，必须经过预备实验。

（3）细菌鞭毛极细，很易脱落，在整个操作过程中必须仔细小心，以防鞭毛脱落。

（4）染色用载玻片干净、无油污是鞭毛染色成功的先决条件。