有许多关于PPO的特异抑制剂的报道。以下只列举一些能够应用于食品工业的抑制剂。

4.5.4.1　取代间苯二酚

从无花果乳胶中获得的蛋白酶，特别是无花果蛋白酶，可以作为食品中褐变抑制剂。无花果蛋白酶的制备主要依靠部分的纯化，非蛋白酶组分也需要制备以观察抗褐变效果。无论是制备热钝化无花果蛋白酶或超滤过的不含无花果蛋白酶的无花果提取物，都对PPO活性有抑制作用，因为这一制备过程包含活性蛋白酶。

从无花果蛋白酶制备过程中分离得到三种抑制剂，根据分析数据显示，无花果提取物中的抑制剂为4-取代基间苯二酚的类似物。即2，4-二羟基二羟肉桂酸，2，4-二羟基二羟肉桂酰丁二胺以及二-（2，4-二羟基二羟肉桂酰）-亚精胺，都是植物的次级代谢产物。除了在制备无花果蛋白酶时可能获得2，4-二羟基二羟肉桂酸，在无花果果实中也可以分离得到。

在体外制备2，4-二羟基二羟肉桂酰丁二胺时，结构类似物二-（2，4-二羟基二羟肉桂酰）-亚精胺也会作为二级反应产物出现。

这一类化合物是酚类底物的结构类似物，通常表现为竞争性抑制（Mayer and Harel，1979）。根据Morrison建立的可逆酶活抑制剂的分类，这一类底物类似物还包括L-含羞草素、环庚三烯酚酮和曲酸，被认为是竞争性的缓慢结合的抑制剂（Jiménez and García-Carmona，1997）。取代基间苯二酚，也是酚类底物的类似物，有学者研究了天然抑制剂和合成4-取代基间苯二酚抑制蘑菇PPO活性的I50值（达到PPO活性抑制率的50%所需要的抑制剂浓度）。间苯二酚是一个弱抑制剂，I50在毫摩尔的范围内，然而其4位取代物则降低了I50值，最低的I50值是在4位的疏水取代基，如4-己基-，4-十二烷基和4-三己基间苯二酚，其I50值分别为0.5、0.3和0.2。

间苯二酚衍生物，取代基在5-，2-和1，3-位的，也为PPO的抑制剂。间苯二酚的5-位取代基和4-取代基间苯二酚的抑制作用相似：疏水取代基的链长越长，则I50值越低。5-取代基间苯二酚在体外试验中表现出良好的PPO抑制作用。这些化合物同样可以在自然界中发现，然而这些化合物并不适合在食品中应用，主要因其毒性和刺激性。相对于间苯二酚，2-位和1，3-位取代基会极大地提升I50值。即使在最大的溶解量下，这些化合物也只显示出较弱的PPO抑制活性。

4-取代基间苯二酚中，4-己基间苯二酚最有可能应用于食品工业中，主要在于其较低的I50值，在真实食品体系中也有较高的抑制率，且这一化合物在非食品已被长期使用，且稳定而安全。相关学者对4-己基间苯二酚成为潜在的食品添加剂的应用也做了大量的毒理学实验。

最初是在抑制虾的黑斑病（黑点）中对4-己基间苯二酚进行了透彻的研究。黑斑是由虾中内源PPO引起的，会降低虾产品的商品价值。在不同处理条件下，4-己基间苯二酚对保持虾品质的作用分别通过实验室和实地测试过。在相同质量下，这一高效的抑制剂比亚硫酸氢盐更为有效，并被证明在成本基数上胜过亚硫酸盐，同时在不同地方处理也没有任何区别。4-己基间苯二酚是一种水溶性的，且稳定的化合物，同时无毒、无致癌、无致突变性，被认为是可以安全使用（generally recognized as safe，GRAS）在抑制虾的黑化病等方面。该化合物与酶形成无反应性的复合体，从而抑制褐变。使用4-己基间苯二酚作为抑制虾的黑化病的加工助剂，对受试虾的风味、质地和色泽没有不良影响，主要在于其在虾肉中的残留非常低（＜1ppm）。

实验室相关研究表明，4-己基间苯二酚对于抑制新鲜的和热风干燥的苹果、土豆片和鳄梨的褐变非常有效，同时，对于液态食品体系，如苹果汁和白葡萄汁等也有作用。4-己基间苯二酚对于抑制苹果汁的褐变十分有效，而间苯二酚既不能作为苹果PPO的底物，也不能作为其抑制剂，同时还有可能激活苹果PPO催化的绿原酸氧化。

动力学研究表明，4-己基间苯二酚以一种非经典的方式抑制PPO活性，表现出一段较长的过渡相。酶促反应的曲线在反应初期显示出降低的趋势，随后反应速率变得平缓。随着抑制剂浓度的增大，初始速率和恒定速率降低。抑制剂不会与自由态的酶（金属态）结合，必须考虑到酪氨酸酶的二酚酶活性的内在机制。氧化态的酶比金属态的酶具有更好的底物亲和性，这一过程需要氧化态的酶结合两个二酚底物以完成整个催化循环。因此，底物的存在（即催化活性的出现）对于抑制剂的缓慢结合是非常必要的。如图4-5所示，4-己基间苯二酚不能视为一种经典的竞争性抑制剂，并且与之前其他描述的缓慢结合型抑制剂不同，因为这一抑制剂的功能的发挥，需要经历一个酶促循环才能实现（Jiménez and García-Carmona，1997）。4-己基间苯二酚通过抑制PPO活性来阻止黄酮醇的氧化（Jiménez and García-Carmona，1999）。

相对于亚硫酸盐而言，4-取代基的间苯二酚在食品工业中的应用有更多的优势。这其中包括：（1）这些化合物是特异而且有效的PPO抑制剂，比亚硫酸盐具有更低的有效使用浓度；（2）4-取代基的间苯二酚不会漂白色素，而过量的亚硫酸盐可以漂白色素；（3）4-取代基间苯二酚比亚硫酸盐具有更好的化学稳定性。因为间苯二酚衍生物的浓度可以更低，因此比亚硫酸盐更有成本竞争力。

图4-5　L-含羞草素对青蛙上皮细胞酪氨酸酶的缓慢抑制

Mechanism proposed by Cabanes et al.（1987）for the slow inhibition of frog epidermis tyrosinase by L-mimosine：Emet，met form of tyrosinase；Eoxy，oxy form of tyrosinase；D，o-diphenolic substrate；EoxyI*，enzymeinhibitor complex formed by slow isomerization of EoxyI complex（Jiménez and García-Carmona，1997）.

4.5.4.2　芳香羧酸

由于芳香羧酸是酚类底物的结构类似物，因此其也可以作为PPO的抑制剂。在模型系统中，抑制剂类型取决于受试底物，可以为竞争性抑制剂、非竞争抑制剂或混合型抑制剂。采用4-甲基儿茶酚作为底物时，肉桂酸和苯甲酸对葡萄PPO的抑制为竞争性抑制剂，但是以咖啡酸作为底物时，抑制类型则为非竞争性抑制。肉桂酸及其类似物，p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸是苹果PPO的有效抑制剂，其Ki值比苯甲酸及其类似物（对羟基苯甲酸、香草酸和丁香酸）低2～30倍。不饱和键，如肉桂酸的侧链是抑制剂中起决定作用的重要结构特征。苯甲酸衍生物比苯乙酸、苯丙酸和羟基苯丙酸具有更强的抑制作用。对于肉桂酸和苯甲酸化合物，对羟基取代物具有部分的提升抑制作用，而在间位增加一个或两个甲氧基团会降低这些化合物的抑制能力。苯甲酸或肉桂酸的羧基被酯化后，将导致抑制作用的严重削弱。酸对抑制度的作用与pH相关，随着pH值的降低，其抑制强度增大。未解离的羧基可能与酶的铜离子活性中心结合成为一个复合体。(www.daowen.com)

有学者研究了肉桂酸，对香豆酸和苯甲酸作为苹果汁的抗褐变剂的作用。不同浓度的各种酸被加入到鲜榨的苹果汁中，并向其中鼓泡以促进褐变。肉桂酸（或其溶解度更高的钠盐）在0.01%或更低的浓度下，是最有效的抗褐变剂，能够长久地抑制褐变。肉桂酸及其衍生物表现出不同的抑制类型，肉桂酸（非竞争性）强于4-羟基肉桂酸（竞争）强于4-甲氧基肉桂酸（非竞争性）。2-羟基肉桂酸对二酚酶活性没有抑制作用。这些抑制剂可能附着于酶的非活性中心部分，并通过空间位阻或酶的构象变化妨碍了底物与酶的结合（Shi and Chen et al.，2005）。

浓度为0.01%～0.04%的肉桂酸钠和0.02%的抗坏血酸组成的复合抑制剂，比两者单独使用能够更有效地抑制澳洲青苹果汁的褐变。采用肉桂酸钠（浓度0.2%）能够在短期内抑制醇露苹果的褐变，然而24 h后，肉桂酸钠诱导了苹果块的褐变。将肉桂酸钠和抗坏血酸复合使用，相比于单独使用抗坏血酸，能够更有效地延长苹果块的初始迟滞期。肉桂酸及其钠盐具有诱导褐变的倾向，这成为应用这些化合物的主要问题。食品的缓慢褐变表明切片表面的外源肉桂酸逐渐转变为PPO的底物，这可能是由于肉桂酸羟化酶或其他酶的作用促进了多酚类化合物的合成。肉桂酸的羟化作用导致对香豆酸（一种PPO的抑制剂）被羟化为咖啡酸（PPO的底物）。

苯甲酸钠在对澳洲青苹果汁的抗褐变性能中显示出了良好的浓度-效应关系。0.1%的苯甲酸钠和0.02%的抗坏血酸钠（酸未被使用，以避免造成苯甲酸盐的沉淀）或抗坏血酸-2-磷酸盐在抑制果汁褐变的过程中（24 h）有协同作用。两种抑制剂的复合作用可以延长初始迟滞期。澳洲青苹果块在含有苯甲酸盐溶液中浸泡，或与抗坏血酸复合后，表现出短期的褐变抑制作用，但是最终在贮藏6 h后，发生了严重褐变。这可能是由于肉桂酸盐和苯甲酸盐能够缓慢转变成PPO的底物。对-烷氧基苯甲酸也可以抑制PPO活性，并且这一抑制是浓度依赖的（Shi and Chen et al.，2005）。

4.5.4.3　脂肪醇

有学者报道了PPO能被乙醇抑制，但是其他脂肪醇的抑制情况尚属空白。在天然脂肪醇对葡萄PPO的抑制研究中，相关学者发现抑制效应随着脂肪醇C原子数目（从1至5的碳原子数）的增多而增大。不同醇类的抑制效用如下：伯醇强于仲醇强于叔醇。学者们试图建立抑制效用和醇的疏水效应之间的关系。对于伯醇，其对应关系是非线性的，表明有其他因素在起作用。

4.5.4.4　氨基酸、多肽和蛋白质

有学者研究了蜂蜜对苹果片、葡萄汁和模型体系褐变抑制。白葡萄和切片水果浸入20%的蜂蜜溶液中，能够保持其天然的风味、质地和色泽，而采用亚硫酸盐处理，则没有这样的效果。糖溶液能够抑制褐变，主要在于其能够降低氧溶解的浓度，以及氧在果蔬组织中扩散的速度。有学者研究了采用8%的蔗糖溶液（10%蜂蜜中含有的蔗糖浓度）和10%的蜂蜜处理苹果片，其褐变速率发生的情况，结果表明，采用蜂蜜处理苹果片可以获得最低程度的褐变。这表明除了糖以外，蜂蜜包含抑制PPO的其他成分。采用柱层析纯化蜂蜜，可以获得一个具有高抑制活性的组分，而这一组分是一种小肽，其分子量大约为600 D。另，有学者认为蜂蜜蛋白可以和植物单宁形成复合物，从而阻止氧化变色。

蛋白、多肽或氨基酸可以通过对PPO的直接抑制作用以及和PPO催化产物醌发生反应，或者通过螯合PPO活性中心的铜，从而影响PPO催化的褐变反应。不同甘氨酰-二肽能影响PPO活性，比如甘氨酰天冬氨酸、甘氨酰苯丙氨酸、甘氨酰甘氨酸、甘氨酰赖氨酸、甘氨酰酪氨酸和甘氨酰组氨酸。这些化合物在1～50 mM的浓度时，能够影响醌类化合物的生成（Girelli and Mattei et al.，2004）。以D，L-多巴或4-甲基儿茶酚作为底物，Kahn研究了蛋白、蛋白水解物和氨基酸对蘑菇、鳄梨和香蕉PPO的活性的影响。酪蛋白水解产物和牛血清白蛋白不能抑制蘑菇或鳄梨的PPO活性。毫摩尔浓度的L-氨基酸、赖氨酸、甘氨酸、组氨酸和苯基丙氨酸（有效性依次递增）会微弱地抑制蘑菇PPO的活性，最大抑制率为60%。三甘氨酸、二甘氨酸和甘氨酸（有消音管一次递减）可以减少蘑菇PPO的色素物质形成。组氨酸（230mmol/L）对鳄梨的褐变具有轻微的抑制作用，而赖氨酸（230mmol/L）对香蕉和鳄梨都无效。对于所有受试氨基酸而言，L-半胱氨酸是最有效的。

4.5.4.5　阴离子

无机卤化物被认为是PPO的抑制剂，但是其他的阴离子，如硫酸盐或硝酸盐，则无效。这可能是由于后两者的离子半径更大所致。卤化物对PPO的抑制作用与pH相关，随着pH增高而降低，其最大抑制率在pH 3.5～5.0范围。卤化物的pH效应可能是由于带负电荷的抑制剂和PPO上带正电荷的咪唑基团有相互作用。卤化物的抑制能力从大到小依次为F＞Cl＞Br＞I。这恰好是离子半径递减的顺序，因此空间位阻效应可以解释这之间的差别。有学者发现卤化物作为PPO抑制剂，其有效性顺序决定于酶的来源。学者们假设可以观察到的抑制效果是铜离子活性中心相对于卤化物的可接近性，以及铜-卤化物复合体的稳定性，这两者的组合决定了抑制效果。采用Lineweaver-Burk分析，在pH为4.5的情况下，氯化钠对苹果PPO的抑制为非竞争性抑制。其他卤化物在相同pH值下为竞争性抑制。氟化钠是最有效的抑制剂，其表观Ki值为0.07 mmol/L，而溴化物和碘化物的值则分别为106 mmol/L和117 mmol/L。

在卤化盐中，氯化钠和氯化钙（浓度为2%～4%，w/v）是食品工业中在褐变抑制方面应用最广泛的化合物。钙盐还具有保持果实组织质地紧密的作用。相关报道表明，氯化锌比氯化钙具有更高的褐变抑制效果。

4.5.4.6　曲酸

曲酸（5-羟基-2-羟甲基-γ-吡喃酮）是曲霉菌和青霉菌的代谢产物，在许多发酵的日本食品中含有曲酸。曲酸是一种抗细菌和抗真菌的化合物，具有还原性、抗氧化性，可以抑制蘑菇PPO的活性。抗坏血酸和曲酸的混合物已经在食品抗褐变剂中申请了专利使用。

相关学者最近发现曲酸可以抑制虾的黑化病。在1%的曲酸溶液中浸泡1分钟，可以达到和1.25%的亚硫酸氢盐一样的延缓黑斑形成的效果。曲酸具有直接抑制PPO活性的作用，同时可以漂白已形成的黑斑。曲酸在阻止虾的黑化病形成过程中主要起两个方面的作用：直接抑制PPO的活性，以及还原色素物质或色素前体物质，并形成无色化合物。一些植物和甲壳类动物的PPO的相关后续研究也有相同的结果。

虽然食品中曲酸是一种天然发酵产物，但其作为食品添加剂的应用则被质疑，主要在于其潜在的毒性作用。一些动物实验发现，曲酸具有急性毒性效应，这些效应包括肾病和致命性。曲酸可以导致老鼠肝脏细胞的遗传毒性和鸡胚胎的畸形。曲酸在鼠伤寒沙门氏菌中还表现出致突变性。除了毒性以外，曲酸在食品工业中的应用还受其价格和大规模生产的限制。