PPO属于被广泛研究且进行详细特征描述的酶家族,但有关该酶在活性差异(酪氨酸酶和儿茶酚氧化酶活性)、异构体、四级结构、物种特异性、抑制程度差异、植物中时空表达差异以及对植物的作用等方面还有很多问题未完全解决。
目前,结合各种新方法的研究为描述PPO复杂系统的特征提供了前所未有的观察结果(Mayer,2006)。对自然现象的分子研究被视为理解酶促褐变反应本质的新工具,为我们提供了基因组学、蛋白质组学和代谢组学水平的附加信息;卓越的综述研究清晰地展示了基于新规律在学科认识和应用价值方面所获得的进展(Bonghi and Trainotti,2006;Chen and Harmon,2006;Boschetti and Righetti,2008;Gstaiger and Aebersold,2009),这些研究为将来直接解决褐变反应提供了整体分析。
在基因组学领域,全基因组的发表可提供有价值的信息。借助转录,可获得植物根、茎、叶、芽和花中三个阶段(转录前、转录和转录后)的序列信息。有较高比例的基因在新陈代谢和细胞周期中发挥作用,这些信息将作为分析该物种分子特性的基础。有报道称,鳄梨种子和果实表达的基因具有相似性,但它们与根部表达的基因存在明显差异;这些差异可能与该物种中不同组织和花朵中观察到的PPO差异性有关(Ibarra-Laclette et al.,2015)。
蛋白质组学研究表明,鳄梨果肉中共存在1012种蛋白质,其中64%(648种)是新种类(Esteve et al.,2012),这一结果暗示在该领域仍有巨大的研究空间。在“组学”学科进展的最后环节,代谢组学可以对收获前和收获后果蔬的代谢物变化进行特性描述(Pedreschi et al.,2014;Donetti and Terry,2014),例如,分析在不同产区、成熟度和贮藏条件情况下,脂肪酸或C7糖的演化,分析外部因素(天气、农艺管理情况等)间与代谢过程的相关性信息等。有研究利用化学计量学(主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA))对13个鳄梨品种在两种成熟度下的代谢水平进行分析。甘露庚酮糖、十五烷基呋喃、天冬氨酸、苹果酸、硬脂酸、柠檬酸、泛酸、甘露醇和β-谷甾醇是成熟阶段最具影响力的代谢物,这些结果暗示了代谢组学在阐述水果成熟机制方面所起的重要价值(Hurtado-Fernández et al.,2015)。
尽管目前缺少有关PPO催化反应机制的进一步分子信息情况,但考虑到褐变反应多方面的特点,推测在其他变量作用下,褐变反应可能增加了代谢物的多种特征(Toledo and Aguirre,2016)。(www.daowen.com)
通过经典物理学中的量子力学规律,对物质的原子尺度进行描绘,这种预测性的计算化学法可以详细地定义褐变反应机制,并获取传统测试法难以获得的信息。但对于此类研究方法而言,PPO活性中心位点的复杂度成为一大障碍,这主要由双铜原子(占据d轨道)的多构型电子特性引起,该方法已在PPO反应加合物特征描述方面取得进展。基于数据库中的基因序列和晶体结构信息,可以采用计算机模拟的方式研究PPO与底物相互作用的机制。这类特征描述主要集中在生物模拟的铜分析,它模拟酶在生物学水平上的铜原子的配位,特别是从电子角度对含有分子氧的酶复合体进行阐述,并定义具有最低能量的可能构象,同时对比各种可信的计算法,以达到在不失去精度的情况下,对核心结构的最有效的描述。过氧化态形式是氧的突出特点,它从侧面与铜中心形成双配位结构(Zapata-Rivera et al.,2011b;Zapata-Rivera et al.,2011a),由此为这一酶家族参与的复杂催化循环提供了相关信息。
在最近结合实验方法和计算方法的研究中,利用密度泛函理论(DFT)B3LYP法和Ahlrich triple-ξ偏振(TZVP)可以确定酪氨酸与酶的过渡转变有关(Ginsbach et al.,2012)。尽管如此,由于这一系统的单基准特点,灵敏度依赖功能用途和自旋污染,应用该方法得到的结果受到质疑(Zapata-Rivera et al.,2011b)。有趣的是,目前也已公认,虽然所有PPO活性中心的双铜原子都具有相同的反应活性,但不同的底物可以与次级配位层残基发生差异化的相互作用,这最终决定了不同亚类或是PPO的活性的作用,包括NSpF家族的后续整合(Ginsbach et al.,2012)。
在最新的研究中,利用经典的分子动力学模拟法对蘑菇酪氨酸(蛋白质数据库编号2Y9W)全结构进行动态特征描述(Ioniţǎet al.,2014)。尽管这种模拟能较好地接近真实的结构运动(从传统观点),但是该方法并不能评估酶系统的反应活性。为解决这一难题,研究者开发出了结合分子动力学模拟(研究生物大分子的动力学行为)和电子描述(活性位点原子发生反应时)的多尺度法(Warshel and Levitt,1976)。这一方法曾被用于解释酪氨酸酶催化的羟基化反应的第一步,结果存在差异(Siegbahn and Borowski,2011);这些差异似乎与催化前复合物晶体结构有关。
已有文章对多尺度法进行优秀的综述报道(Warshel,2003;Kamerlin and Warshel,2011),它还曾用于其他金属酶(Saura et al.,2014)和其他酶系统(Monard et al.,2003;Gómez et al.,2012),这些研究为详细描述与之相关的现象和反应机制提供了有价值的信息;也有利于建立全面信息来解释由PPO引起的酶促褐变反应所表现出的复杂现象(Toledo and Aguirre,2016)。
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