基于酪氨酸酶和儿茶酚氧化酶活性由同一个结构催化的事实（Mayer，2006），双铜原子有同样的催化潜能，因此推测其他因素调节这一反应；有些物种的PPO具有双活性，但是有些仅能催化邻苯酚氧化。PPO在物种间的巨大差异并未得到深入探讨，借助铜原子可有效解释酶家族巨大差异的机制。

PPO单酚和二酚氧化作用的总体机制如图2-1所示，因整合了双活性过程，它为结构上的反应过程和结构状态的转变提供了清晰观点。基于铜活性位点的几何结构和电子结构，可以推导该酶的催化作用机理，其结构类似于行使氧转运功能的血蓝蛋白（Gerdemann and Eicken et al.，2002）。

图2-1　PPO对一元酚和二元酚的氧化途径

Schematic illustration of the mechanism of PPO including the structures of the o-diphenol and monophenol substrates for the catecholase and monophenolase reactions（Boeckx and Winters et al.，2015）.

酶活性位点由两个铜原子与三个保守的组氨酸残基配体组成，催化过程中，酶活性位点结构发生改变（Klabunde et al.，1998），这与其电子性质的改变有关，在酪氨酸酶活性催化循环中，两个耦合的铜以三种形态存在（met，deoxy，oxy），即met-PPO（Cu＋2）、脱氧-PPO（Cu＋1）和氧化-PPO（Cu＋2）。该酶的静止形式被认为是met-PPO。它通过将单分子儿茶酚氧化为邻苯醌，从而还原为脱氧PPO。单酚氧化途径中酶活性部位结合氧气分子形成含氧PPO中间体。单酚类底物只能与含氧PPO反应形成PPO-氧-单酚三元复合物（Lerch，1995）。当单酚形成邻苯醌后，产物与PPO脱离。PPO转化为脱氧PPO，且不需循环经过静止形式即可参与新一轮循环。在二酚氧化途径中，双酚底物的反应可以与含氧PPO和met-PPO发生反应。Met-PPO氧化一分子的邻苯二酚，并还原为脱氧PPO，之后结合氧气，形成含氧PPO形式，并形成邻苯二酚-PPO复合物。在儿茶酚氧化为邻苯醌后，酶还原到met-PPO形式（Lerch，1995）。

动力学结果表明，在有序的序列机制中，酶首先结合氧再结合单酚。虽然随机序列机制可以解释邻苯二酚和氧与酶（脱氧PPO）结合的过程，但考虑到化学循环步骤中近端途径机制时，这似乎依然是有序的过程。在有序的Bi Bi机制中，一般情况也假定氧气是二酚酶活性中第一个被PPO结合的底物，然而，复合物中各产物的去除顺序尚未阐明（Gerdemann and Eicken et al.，2002）。

Wilcox等人（1985）比较了不同的单酚和双酚底物的氧化过程的反应动力学常数，表明在单酚中，体积较大的取代基会显著降低羟基化反应速率，而二元酚的取代基大小对其氧化速率影响不大。这说明在铜催化位点周围的蛋白口袋处，单酚经历了从轴向到赤道向的排列，各苯环取代基之间可能存在空间位阻（Wilcox et al.，1985），而PPO催化二酚氧化为邻苯醌却少有几何结构和电子等要求。后来，为研究苯环不同取代基对PPO催化反应速率的影响，以苹果、梨（Espin et al.，1998b）和蘑菇（Espin et al.，2000）为对象进行了定量研究（核磁共振分析及动力学数据分析），实验结果表明，如果取代基具有高电子供体能力，那么单酚羟基的氧原子对双核铜中心的亲核效应就会明显加强，因此，具有高的电子供体取代基的单酚氧化更迅速。然而，侧链取代基的大小（位阻效应）对催化速率影响并不显著，这是由于单酚的亲核能力低；对邻苯二酚而言，取代基的电子供体能力被证明对氧化速率的影响不大，但取代基的大小（位阻效应）变得非常重要（Espín and Varón et al.，2000）。(www.daowen.com)

综合考虑动力学因素，以及基于粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）PPO反应途径中三种状态下酶的形式（met-PPO，deoxy-PPO和oxy-PPO），整理得到一个不同植物来源PPO中单酚酶和二酚酶活性反应机制的模型（见图2-2）（Fenoll and Rodri'guez-López et al.，2001）。该反应机制可以解释不同果蔬中单酚酶和双酚酶的活性作用。这一模型额外引入了化学氧化还原的循环过程，在酶催化的作用下，邻苯二酚产生两个邻苯醌。

如图2-2所示，单酚氧化路径从PPO所具有的单酚酶活性开始。在这一作用过程中可以观察到典型的滞后期，可以理解为形成足够数量的邻苯二酚使met-PPO转变成oxy-PPO是需要一定时间的。在单酚氧化路径中，met-PPO-单酚是一个末端复合体，因此结合单酚的met-PPO不表现酶活性，滞后期随着单酚浓度升高而延长，从而需要更多的时间达到平衡。与此同时，醌化学循环产生的邻苯二酚驱动末端复合体即met-PPO-单酚进入催化循环过程，可以产生必要的邻苯二酚水平以维持平衡状态。然而，随着酶浓度的增加滞后期缩短，反应体系产生更多的oxy-PPO，邻苯二酚剂量增加会消除滞后期，加速了平衡状态的到来（Rodriguez-Lopez and Tudela et al.，1992）。

尽管尚未完全清楚上述反应机制是否适用于所有PPO，但铜对PPO活性的必要性都是统一且显而易见的。利用铜螯合剂从酶中除去铜将会导致酶活性相对降低，且该酶活性可以通过加入过量的铜复原（Yoruk and Marshall，2003）。从植物、动物、真菌和细菌PPO的氨基酸序列信息可知，它们都具有两个保守的铜离子结合位点——CuA和CuB（Gooding and Bird et al.，2001）。这种双核铜是酶与底物发生相互作用的位点。此外，序列对比研究显示存在于节肢动物和软体动物中的血蓝蛋白与一些PPO在铜结合配体处具有较高的同源性（Klabunde and Eicken et al.，1998）；通过X射线晶体衍射分析得到的血蓝蛋白结构可以作为研究PPO的切入点，预测出PPO活性位点的结构模型。

图2-2　PPO对单酚和邻苯二酚耦合邻醌非酶促反应的反应机理

Emet，met-PPO；Edeoxy，deoxy-PPO；Eoxy，oxy-PPO；T，单酚；QH，oquinone-H＋；D.o-diphenol；DC，aminechrome.