理论教育 多酚氧化酶导论:反应特异性

多酚氧化酶导论:反应特异性

时间:2023-10-17 理论教育 版权反馈
【摘要】:另外,在羟基化反应中,根据以往认定的一般机制,邻苯二酚仍结合在活性位点,当采用标准比色法时很难检测邻苯二酚。在这两种案例中,PPO反应性能的结果出现矛盾,这可能是由于提取纯化过程或检测方法灵敏度的差异所致。PPO对单酚的催化活性可能是其固有属性,但在体外条件下,由于单酚氧化酶的不稳定性,天然多功能酶的反应特性可能发生改变。另外,相比于二酚酶,测定单酚酶活性可能需要不同的最佳检测条件。

多酚氧化酶导论:反应特异性

1975年,测定了三个鳄梨品种(Fuerte,Horishim和Lerman)儿茶酚活性,结果显示Fuerte中的PPO活性显著高于另外两种,且褐变水平与PPO活性直接相关(Kahn,1975)。不过,该研究忽视了羟基酶活性和酪氨酸酶活性之间可能存在的关联。1983年,有研究明确称,鳄梨中PPO既不是儿茶酚酶也不是酪氨酸酶(Van Lelyveld et al.,1984)。鳄梨PPO活性报告指出Hass品种有双活性,这一结果突出了使用Triton X-114(聚氧乙烯单叔辛基苯基醚)和一个亲核的拖车分子(如3-甲基-2-苯并噻唑腙盐酸盐)必要性(Espín et al.,1997)。事实上,先前的研究之所以不能确定双活性,主要是常规的纯化处理中酪氨酸酶的羟基化活性发生修饰(Walter and Purcell,1980)。另外,在羟基化反应中(酪氨酸酶反应第一步),根据以往认定的一般机制,邻苯二酚仍结合在活性位点,当采用标准比色法时很难检测邻苯二酚。

很多物种的PPO同时表现出单酚酶和二元酚酶活性,如苹果(Espin and Morales et al.,1995;Espín and García-Ruiz et al.,1998),鳄梨(Kahn and Pomerantz,1980;Espín and Trujano et al.,1997),蚕豆(Jiménez and García-Carmona,1996),番荔枝(Martinez Cayuela and Medina et al.,1988),野蔷薇(Sakiroglu and Küfrevioglu et al.,1996),茄 子(Perez-Gilabert and García Carmona,2000),葡 萄(Valero and Varón et al.,1988;Sánchez-Ferrer and Bru et al.,1989),猕猴桃(Park and Luh,1985),蘑菇(Saboury and Zolghadri et al.,2006),小龙虾(Cárdenas and Dankert,2000)和马铃薯(Sanchez-Ferrer and Laveda et al.,1993),而存在于可可豆(Lee and Lee et al.,1991),生菜(Heimdal and Larsen et al.,1994),龙眼(Jiang,1999),菠萝(Das and Bhat et al.,1997)等中的PPO缺乏羟基化活性,并只对邻苯二酚起作用。在高等植物中,PPO普遍表现为二酚酶活性。当同时存在单酚酶和二酚酶活性时,单酚酶对二酚酶活性比在1∶10至1∶40之间变化,这主要取决于植物来源(Nicolas et al.,1994;Perez-Gilabert and García Carmona,2000)。获得兼具酪氨酸酶和儿茶酚氧化酶活性的酶晶体结构为阐释这类酶的神秘行为迈出了重要一步。比较分析表明这两种活性由同一个结构催化;然而对该反应机制的动学推测表明,由环境引起的构象变化(底物、产物和辅因子)能明显地促进某一酶活性超过另一酶。在接近生理pH值的茄子(Perez-Gilabert and García Carmona,2000),土豆(Sanchez-Ferrer and Laveda et al.,1993)和香蕉(Sojo and Nuñez-Delicado et al.,1998)中,二酚氧化胜过单酚氧化,占据氧化的主导方面。

关于是否所有PPO均可以执行单酚酶功能这一问题尚无定论。早期关于菠菜的研究表明,PPO只有二酚酶活性(Golbeck and Cammarata,1981;Meyer and Biehl,1981),而随后的研究报道菠菜PPO也有单酚酶活性(Sánchez-Ferrer and Villalba et al.,1989);同样,对于草莓PPO,起初报道其只作用于邻苯二酚(Wesche Ebeling and Montgomery,1990),但后来被证明也具有单酚酶活性(Espín and Trujano et al.,1997)。在这两种案例中,PPO反应性能的结果出现矛盾,这可能是由于提取纯化过程或检测方法灵敏度的差异所致。无法测得某些香蕉的单酚酶活性可能是由于在提取和纯化过程中该酶已经失活。

PPO对单酚的催化活性可能是其固有属性,但在体外条件下,由于单酚氧化酶的不稳定性,天然多功能酶的反应特性可能发生改变。在体外实验的准备过程中,一些物理化学条件的变化可能引起双铜原子相对位置的改变,在酶活性部位中双铜活性位点的改变可能伴随着单酚酶活性损失。(www.daowen.com)

在某些情况下,单酚酶活性的缺乏是由于其存在潜伏性(Sellés-Marchart and Casado-Vela et al.,2006)。蚕豆PPO具备潜伏性,其潜在的单酚酶活性可以被SDS激活,并同时表现出儿茶酚酶的活 性,从 而 被 检 测 到(Jiménez and García-Carmona,1996;Gandía-Herrero and Jiménez-Atiénzar et al.,2005)。香蕉果肉中潜伏态的PPO单酚酶活性也受SDS影响,在2mmol/L表面活性剂存在的情况下,SDS浓度增加导致单酚酶活性极大增加(Sojo and Nuñez-Delicado et al.,1998)。经胰蛋白酶激活后,桃PPO具有单酚酶活性(Laveda and Núñez-Delicado et al.,2001)。另外,相比于二酚酶,测定单酚酶活性可能需要不同的最佳检测条件。某些条件下,由于无法在实验条件下消除滞后期或检测方法的灵敏度较低,因此会观察到单酚酶活性缺失的现象。也有学者认为,在缺失天然邻苯二酚的情况下,滞后期延长,这可能在纯化过程中掩盖单酚酶活性(Sanchez-Ferrer and Laveda et al.,1993)。

多酚氧化酶家族的两种活性表现存在物种差异,对不同物种内这一现象已建立起多种解释(Rodriguez-López et al.,1992;Sánchez-Ferrer et al.,1995),同时研究者也意识到体系的复杂性,且强调了诱导酶促褐变的诸多原因,这为建立该酶家族反应的综合机制带来挑战。另一现象也增加了建立综合机制的难度:在表现酪氨酸酶活性的物种中,当反应产物(如Try为底物反应产物为L-多巴)出现后,羟基化反应的滞后期消失(Yoruk and Marshall,2003)。物种间PPO的序列、底物选择性和催化能力方面存在巨大差异性(Jaenicke and Decker,2003;Malviya et al.,2011)。已有研究表明,PPO甚至能够由多种基因在不同物种的不同部位编码(Shaw and Chao,1991),并且表现时间特异性(Gooding et al.,2001)。

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