酪氨酸酶的主要内源性底物为L-酪氨酸、对氨基苯酚以及它们同谷氨酸、γ-谷氨酰胺-4-羟基苯（GHB）形成的缩合物，所有物质皆起源于莽草酸通路。Jimenez和Garcia-Carmona依据邻苯醌产物的发展将酪氨酸酶底物大致分为3个组别（Jiménez and García-Carmona，1996）：

（1）产生环化、可进行苯环分子内1，4加成的邻苯醌的底物；

（2）产生非环化、能与水分子加成的邻苯醌的底物；(www.daowen.com)

（3）产生高度稳定邻苯醌的产物。

酪氨酸酶可利用单酚、二元酚及三元酚作为底物，不过二元酚底物亲和性最强，另有报道称在单酚（对甲酚和酪氨酸）、二元酚（儿茶酚、L-多巴、D-多巴、儿茶酸和绿原酸）、三元酚（邻苯三酚）中，以儿茶酚为底物时酶活性最强。Espin等人对利用多种对映体（D型、L型和外消旋酪氨酸，甲基酪氨酸，多巴，甲基多巴和异丙肾上腺素）对酶分别作为单酚酶和二元酚酶的底物立体专一性进行试验。结果发现，L型底物比D型底物具有更低的米氏常数，这表明酪氨酸酶对底物的亲和存在立体专一性，进一步研究还发现，含电子受体酚类是比含电子供体酚类更低效的酶底物（Espin and Garcia-Ruiz et al.，1998）。此外，酪氨酸酶的亲和力（1/Km）与催化能力（Vmax/Km）随底物芳香环侧链体积的减小而增大（Seo and Sharma et al.，2003）。