1）目的要求

①了解酶联免疫吸附试验夹心ELISA的机理。

②掌握酶联免疫吸附试验夹心ELISA的方法。

2）基本原理

双抗体夹心法方法的基本原理可用图9.9来表示。

图9.9　双抗体夹心法测抗原示意图

3）实验材料及仪器

酶联检测仪，酶标板，微量加样器，鸡传染性法氏囊病病毒，酶标抗体，阳性血清，阴性血清，待检血清，pH9.6碳酸缓冲液，洗涤液（PBS-T），BSA（牛血清白蛋白），封闭液，稀释液，底物溶液，30%双氧水，2 mol/L H2 SO4溶液。

四甲基联苯胺（TMB）显色液：

底物显色A液：醋酸钠13.6 g，柠檬酸1.6 g，30%双氧水0.3 mL，蒸馏水加至500 mL。

底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠0.2 g，柠檬酸0.95 g，甘油50 mL，0.15 g TMB溶于3 mL DMSO中，蒸馏水加至500 mL。

注意避光保存，使用的时候根据需要量取等量AB液混匀后使用。

4）操作步骤

（1）包被

用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/mL。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1 mL，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3 min。（简称洗涤，下同）。(www.daowen.com)

（2）加样

加一定稀释的待检样品0.1mL于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1 h。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。

（3）加酶标抗体

于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1 mL。37℃孵育0.5～1 h，洗涤。

（4）加底物液显色

于各反应孔中加入临时配制的TMB溶液0.1 mL，37℃10 min。

（5）终止反应

于各反应孔中加入2 mol/L硫酸0.05 mL。

（6）结果判定

可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450 nm，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

5）实验报告

（1）结果

完成实验报告。

（2）思考题

间接ELISA与夹心ELISA有何区别？