1）目的要求

①了解酶联免疫吸附试验间接ELISA的机理。

②掌握酶联免疫吸附试验间接ELISA的方法。

2）基本原理

间接ELISA是测定抗体最常用的方法，属非竞争结合试验。基本原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗（针对受检抗体的抗体，如羊抗人IgG抗体）与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。

间接ELISA方法的基本原理可用图9.8来表示。

图9.8　间接法ELISA测抗体示意图

3）实验材料及仪器

酶联检测仪，酶标板，微量加样器，猪瘟病毒，酶标SPA，猪瘟阳性血清，猪瘟阴性血清，待检血清，pH9.6碳酸缓冲液，洗涤液（PBS-T），BSA（牛血清白蛋白），封闭液，稀释液，底物溶液，30%双氧水，2 mol/L H2 SO4溶液，邻苯二胺（POD）。(www.daowen.com)

4）操作步骤

①用包被缓冲液将猪瘟病毒抗原稀释至1～10μg/mL，每孔加0.1mL，37℃包被2～3 h。

②次日用PBS-T洗涤3次，每次5 min，甩干。

③在每孔内加封闭液0.2 mL，37℃封闭3 h。

④重复第②步

⑤加一定稀释的待检血清（未知抗体）0.1 mL于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1 h，洗涤。（同时做3组空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标SPA 0.1 mL，37℃孵育2 h，洗涤3次，最后一遍用DDW（超轻水）洗涤。

⑥加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1 mL，37℃30 min。

⑦终止反应：于各反应孔中加入2 mol/L硫酸0.05 mL。

⑧结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于490 nm，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。