1）新城疫病毒液的制备

一般以新城疫Ⅱ系或Lasota系疫苗进行试验，也可用疫苗接种鸡胚，收获的尿囊液分装于洁净、干燥的青霉素瓶中，冻存于冰箱备用。

2）1%红细胞悬液的制备

灭菌注射器吸取抗凝剂（按每毫升加入灭菌的3.8%枸橼酸钠溶液0.2mL），从成年健康非免疫公鸡静脉或心脏采血，放入灭菌离心管内，以2 000 r/min离心3～4 min，弃去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加入生理盐水，同上法离心3～4次，最后一次5 min，将最后一次离心的红细胞，根据需要量，用生理盐水配成1%的红细胞悬液。

3）操作方法

在96孔V型微量血凝反应板上进行（表9.10）。

表9.10　鸡新城疫病毒血凝试验（HA）的操作术式（微量法）

①加生理盐水：用微量移液器给每孔加入生理盐水50μL。

②加病毒液：换一吸头用移液器取50μL病毒液加入到第1孔，并用移液器挤压3～5次，使病毒液混合均匀，然后取50μL加入到第2孔，混匀后取50μL加入到第3孔，依此倍比稀释到11孔，第11孔混匀后吸出50μL弃去。第12孔作为不加病毒的红细胞对照孔。

③加红细胞：换一吸头每孔加入1%鸡红细胞悬液50μL。

④加样完毕，将血凝板反应板置于微型振荡器振荡1 min，然后置37℃温箱放置15～30 min，待对照红细胞已沉淀可观察并判定结果。

4）结果判定及记录

将反应板倾斜45°，沉于孔底的红细胞沿倾斜面呈现流泪状为红细胞不凝集或不完全凝集；如果孔底的红细胞平铺，凝成均匀薄层，倾斜后不呈现流泪状，表示红细胞被病毒完全凝集。

红细胞完全凝集用“+”表示，不完全凝集用“±”表示，不凝集用“-”表示。新城疫病毒液能凝集鸡的红细胞，但随着病毒液被稀释，其凝集红细胞的作用逐渐变弱。稀释到一定倍数时，就不能使红细胞出现完全凝集，从而出现不完全凝集或不凝集结果。能使一定量红细胞完全凝集的病毒最大稀释倍数为该病毒的血凝滴度，或称血凝价（1个血凝单位——HAU）。如表9.10，新城疫病毒液的血凝价为128倍（27）。

5）病毒的血凝抑制（HI）试验

（1）被检血清的制备

采取经新城疫免疫后鸡的血液，放入干净的平皿内（成一薄层），凝固后，用注射器针头划成菱形血块，置于恒温箱（37℃）内数分钟后，很快析出血清。也可静脉或心脏采血完全凝固后自然析出或离心得淡黄色的液体为被检血清。

（2）4个血凝单位病毒液的制备

根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，然后按照下式计算4个血凝单位病毒液稀释倍数，并用生理盐水进行稀释。(www.daowen.com)

病毒的血凝价

如表9.10中病毒液的血凝价为128倍（27），4个血凝单位病毒的稀释倍数为32倍（25）。

（3）操作方法

同样在96孔V型微量血凝反应板上进行（表9.11）。每排孔可检测1份血清样品。

表9.11　鸡新城疫病毒血凝抑制试验（HI）的操作术式（微量法）

①加生理盐水：用微量移液器给1～11孔加入50μL，12孔加入100μL。

②加被检血清：换一吸头吸取被检血清50μL加入到第1孔，并用移液器挤压3～5次，使血清混合均匀，然后取50μL加入到第2孔，混匀后取50μL加入到第3孔，依此倍比稀释到第10孔，第10孔混匀后吸出50μL弃去。第11孔为病毒对照，第12孔为盐水对照。

③加4个血凝单位的病毒：换一吸头给1～11孔加入4单位病毒50μL。然后，振荡1 min，将反应板置37℃恒温培养箱中作用5～10 min。

④加红细胞：换一吸头给每孔加1%鸡红细胞悬液50μL。振荡15～30 s，37℃培养箱中作用15～30min，待第11孔病毒对照孔的红细胞均匀铺在管壁（100%凝集），取出，观察并记录结果。

（4）结果判定及记录

将反应板倾斜45°，沉于孔底的红细胞沿倾斜面呈现流泪状为红细胞凝集完全抑制或凝集不完全抑制；如果孔底的红细胞平铺，凝成均匀薄层，倾斜后不呈现流泪状，表示红细胞完全凝集。

红细胞凝集完全抑制用“-”表示，红细胞凝集不完全抑制用“±”表示，红细胞完全凝集用“+”表示。能完全抑制红细胞凝集的血清最大稀释倍数叫该血清的血凝抑制滴度或血清的血凝抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数表示。如表9.11所表示的血清的血凝抑制效价为64倍（26）或6（log 2）。

病毒的HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检测血清中的抗体效价，在某些病毒病的诊断及疫苗免疫效果的检测中应用广泛。

6）注意事项

①红细胞的储存：抗凝血在4℃储存时间不能超过1周，如需储存较久，可用阿氏液替换抗凝剂，以4∶1（4份阿氏液加1份血液）比例混合血液，4℃可储存4周。

②反应的温度：不同病毒的血凝性在不同温度下反应明显，如细小病毒4℃，痘病毒则37℃，正黏病毒、副黏病毒4～37℃均可。一般温度高时，结果出现快，需要的时间短，温度低时，结果出现晚，一般需30 min。

③结果的判定：判定时首先应检查对照孔是否正确。如正确则证明各种条件及操作无误，如对照不正确，就必须重作。