1）稀释平板分离

稀释平板分离微生物有倾注法和涂布法两种。本实验分离细菌、放线菌、霉菌时采用倾注法，分离酵母菌采用涂布法。

（1）细菌的分离

①做标记：每组取1瓶99 mL三角瓶无菌水（瓶内带有玻璃珠）和5支9 mL试管无菌水，在三角瓶上标记10-2，在5支试管上分别标记10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。

②制备土壤稀释液：准确称取土样1.0 g，加入装有99 mL并带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，振荡10～20 min，使土样与水充分混匀，将细胞分散，制成10-2稀释度的土壤稀释液。然后按10倍稀释法进行稀释。首先用1支无菌吸管从10-2土壤悬液中吸取1 mL加入标有10-3的9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-3稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-3稀释液1 mL，移入标有10-4的9 mL无菌水的试管中，也吹吸3次，即成10-4稀释液；依此类推，连续稀释（如果是4.5 mL无菌水，则每次转移0.5 mL），制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等一系列稀释菌液。如图9.2所示。

图9.2　从土壤中分离微生物操作过程

③倾注法分离：取无菌平板9套，分别在培养皿底按稀释度编号，对细菌分离而言，取最后3个稀释度，即10-5、10-6、10-7，每一稀释度设置3个重复。用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-7稀释液各1mL放入编号10-7的3个平板中；同法吸取10-6稀释液各1mL放入编号10-6的3个平板中，再吸取10-5稀释液各1mL放入编号10-5的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换，也可每吸1个稀释度后更换1支无菌吸管）。将已灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化，待冷却到45～50℃，分别倾入已盛有上述10-5、10-6、10-7土壤稀释液的培养皿中，每皿倒15～20 mL，将培养皿平放桌上，在桌面上轻轻转动，使稀释的菌悬液与还处于溶化状态的培养基混合均匀，静置桌上冷凝。倾倒培养基时注意无菌操作，要在火焰旁进行，要点是：左手拿培养皿，右手拿装培养基的三角瓶底部，左手同时用小指和手掌将三角瓶瓶塞拔开，灼烧瓶口，用左手大拇指和食指将培养皿盖朝火焰的方向打开一缝，至瓶口正好伸入倾倒培养基。

④培养：冷凝后，倒置在35～37℃恒温培养箱中培养1～2 d，观察结果。

（2）放线菌的分离

①制备土壤稀释液：土样1.0 g，加入装有99 mL并带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，并加入10滴10%的酚溶液（抑制细菌生长，可用1%的重铬酸钾代替，效果更好）振荡10～20 min，静置5 min，制成10-2稀释度的土壤稀释液。再按前法连续10倍稀释，制成10-3、10-4、10-5等一系列稀释菌液。

②倾注法分离：无菌吸管依次吸取1 mL10-5、10-4、10-3土壤稀释液于对应编号的无菌培养皿中，用高氏Ⅰ号培养基依前法倾倒平板，每个稀释度3次重复。

③培养：冷凝后，将平板倒置于28℃恒温培养箱中，培养5～7 d观察结果。(www.daowen.com)

（3）霉菌的分离

①制备土壤稀释液：准确称取土样1.0 g，加入装有99mL并带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，振荡10～20 min，制成10-2稀释度的土壤稀释液。再按前法连续10倍稀释，制成10-3、10-4等一系列稀释菌液。

②倾注法分离：按前法用无菌吸管依次吸取1 mL10-5、10-4、10-3土壤稀释液于对应编号的无菌培养皿中，用马丁氏培养基依前法倾倒平板，每个稀释度3个重复。为了抑制细菌生长和降低菌丝蔓延速度，马丁培养基在临用前无菌操作加入孟加拉红、链霉素和脱氧胆酸盐。

③培养：冷凝后，将平板倒置于28℃恒温培养箱中，培养3～5 d观察结果。

（4）酵母菌的分离

①制备菌悬液：准确称取面曲1.0 g，加入装有99 mL并带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，面曲发黏，先用接种铲在三角瓶内壁磨碎，再振荡10～20 min，制成10-2稀释度的面曲稀释液。再按前法连续10倍稀释，制成10-3、10-4、10-5、10-6等一系列稀释菌液。

②涂布法分离：按前法向无菌培养皿中倾倒已熔化并冷却到45～50℃的豆芽汁葡萄糖琼脂培养基，待平板冷凝后，用无菌吸管依次分别吸取0.1 mL10-4、10-5、10-6 3个稀释度的菌悬液于对应编号的豆芽汁葡萄糖琼脂培养基平板中，每个稀释度3个重复。左手拿培养皿，并用拇指和食指将皿盖在火焰旁打开一缝，右手持无菌涂棒，于平板培养基表面将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。

③培养：冷凝后，将平板倒置于28～30℃恒温培养箱中，培养2～3 d观察结果。

2）平板菌落形态及个体形态观察

从不同平板上选择不同类型菌落用肉眼观察，区分细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落形态特征。并用接种环挑菌，看其与基质结合的紧密程度。再用接种环挑取不同菌落制片，在显微镜下进行个体形态观察。记录所分离的含菌样品中明显不同的各类菌株的主要菌落特征和细胞形态。

3）分离纯化菌株转接斜面

在分离细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的不同平板上选择分离效果好，认为已经纯化的菌落用接种环转接斜面。细菌接种于牛肉膏蛋白胨斜面，放线菌接种于高氏Ⅰ号斜面，霉菌和酵母菌接种于豆芽汁葡萄糖斜面上。贴好标签，将菌株编号，在各自适宜的温度下培养。待菌苔长出之后，检查其特征是否一致，同时将所得菌制片染色后，用显微镜检查是否为单一的微生物，如果发现有杂菌，需要进一步用画线法分离、纯化，直到获得纯培养。