1）培养基配制

（1）称量

牛肉膏3～5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL。

注意：蛋白胨易吸湿，在称取时动作要迅速。

（2）溶化

在上述烧杯中先加入少于所需的水量，用玻璃棒搅匀，然后在石棉网上加热使其溶解，加热搅拌全溶后稍放冷。

（3）调pH值

用酸度计或精密pH试纸测定其pH值，并用10%NaOH调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。

（4）分装

根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的1/2为限。

（5）包扎

试管扎成捆。试管和三角瓶的棉塞外用硫酸纸和牛皮纸包扎，纸上表明培养基的名称、配制日期等。

（6）灭菌

培养基用0.1 MPa，高压蒸汽灭菌15～20 min。

2）其他无菌材料的灭菌前的准备与包扎

（1）无菌水的准备

在试管内盛9 mL蒸馏水（或生理盐水），盖好试管塞，包上牛皮纸。

（2）培养皿的准备

培养皿由1底1盖组成1套。包扎前洗涤干净，晾干或烘干。用报纸将几套培养皿包成一包，或将几套培养皿直接置于特制的铁皮筒内，灭菌备用。(www.daowen.com)

（3）移液管的准备

先在移液管的上端塞入一小段棉花（一般不用脱脂棉），目的是避免外界及口中杂菌吹入管中，并防止菌液等吸入口中塞棉花时可用一根针（如拉直的曲别针）将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而棉花不下滑为准。塞入的此小段棉花距管口约0.5 cm，长度为1～1.5 cm。将报纸裁成宽5 cm左右的长条，再将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，二者约成30°，折叠纸条包住尖端，左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面向前搓转，以螺旋式包扎起来，上端剩余纸条部分，折叠打结。灭菌备用。

3）高压蒸汽灭菌的使用

（1）加水

打开灭菌锅盖，向锅内加入适量的水。不同高压蒸汽灭菌锅加水的方法不同，具体操作见各高压锅说明书。

（2）放入待灭菌物品

注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水顺壁流入灭菌物品。

（3）加盖

将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内，有利于锅内冷空气自下而上排出。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

（4）排放锅内冷空气及升温灭菌

打开排气阀，加热（用电加热或煤气加热或直接通入蒸汽），自锅内开始产生蒸汽后3 min（或喷出气体不形成水雾），此时锅内的冷空气已由排气阀排尽，再关紧排气阀，锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力和温度至所需时间。一般培养基控制在0.1 MPa、121.3℃灭菌20 min，含糖等成分的培养基控制在0.056 MPa、112℃，灭菌30 min，或0.07 MPa、115℃灭菌20 min。灭菌所需时间到后，关闭热源，停止加热，灭菌锅内压力和温度随之逐渐下降。

（5）灭菌完毕降温及后处理

当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，开盖，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。斜面培养基取出后要趁热摆成斜面，灭菌后的空培养皿、试管、移液管等需烘干或晾干。若连续使用灭菌锅，每次要注意补充水分。灭菌完毕，排放锅内剩余水分，保持灭菌锅干燥。

（6）无菌试验

抽取少量灭菌培养基放入37℃保温箱培养24～48 h，若无杂菌生长，即可视为灭菌彻底，可保存待用。

（7）高压蒸汽灭菌注意事项

灭菌时人不能离开工作现场，控制热源维持灭菌时的压力；压力过高，不仅培养基的成分被破坏，而且超过高压锅耐压范围易发生爆炸，造成伤人事故。