抗体能够追踪抗原，在抗原所在的部位与之结合，但这种结合反应一般肉眼不容易观察出来。但有一些物质在超微量时也能用某种特殊的理化特性将其检测出来。免疫标记技术就是利用抗原抗体反应的特异性和标记分子极易检测的高敏感性结合形成的实验技术。免疫标记技术主要有荧光标记技术、酶标抗体技术和同位素标记抗体技术等。它们的敏感性和特异性大大超过常规血清学方法，现已广泛用于传染病的诊断、病原微生物的鉴定、分子生物学中基因表达产物分析等领域。以下主要介绍荧光标记技术和酶标抗体技术。

1）荧光标记技术

荧光抗体技术是将荧光燃料标记在抗体球蛋白分子（IgG）上制成荧光抗体，标记的抗体仍能与相应抗原结合并形成带有荧光的抗原抗体复合物。该复合物在荧光显微镜下可发出荧光，因而可用于检测标本中抗原的存在（定性）或抗原所在部位（定位）。

荧光是一种物质受短波光线（如蓝紫光、紫外光）照射后激发出的波长比激发光更长的可见光，能够在被激发后放出荧光并且能作为燃料的物质称为荧光染料，目前应用最广泛的是异硫氰酸荧光黄（FITC）。FITC为黄色结晶，易溶于水与酒精，低温、干燥可以保存多年，并且呈明亮的黄绿色荧光。本品在碱性条件下可以与IgG起反应形成荧光特性的结合物。

图7.16　直接荧光染色示意图

1—抗原；2—荧光抗体

（1）直接法

将荧光染料与提纯的球蛋白结合，制成与某种抗原相应的荧光抗体用以检测未知抗原。染料时将待测病理组织冰冻切片或触片，细菌材料则做出涂片，自然干燥；病毒抗原常用冷丙酮固定，细菌抗原用加热固定；固定后滴加上述荧光抗体，置湿盒37℃染色30min，用PBS液充分洗涤以除去未结合的荧光抗体，稍干燥后加入pH9的缓冲甘油盐水1滴，加盖玻片封固即可在荧光显微镜下观察，可见抗原所在部位或整个细菌菌体呈现黄绿色荧光，如图7.16所示。

同时设下列对照：

①用荧光抗体染色的正常组织触片，观察应无荧光现象。

②将待检材料先加已知抗血清后用荧光抗体染色，应不出现荧光。

（2）间接法

将荧光染料标记在抗抗体（第二抗体）上制成荧光抗体。如用兔丙种球蛋白免疫羊制成羊抗兔抗血清，然后提纯其IgG，用荧光染料标记即为抗兔荧光抗体，如图7.17所示。该抗体可以用于检测抗原，使用时只要制备兔抗，该抗原的抗血清（第一抗体）即可进行检测，其优点是只需制备一种荧光抗抗体，便可用于多种抗原或抗体的检验。

荧光标记抗体制备简单，市场已有出售，可以应用于抗原抗体快速诊断以及抗原定位。(www.daowen.com)

图7.17　间接荧光抗体染色法

2）酶标记抗体

酶标记抗体是20世纪60年代发展起来的一门技术，可用于定性、定量或定位检测，其敏感性和特异性都较高，并且无需特殊设备，因此应用十分广泛。

（1）酶标记抗体的原理

酶标记抗体技术是通过化学方法将酶与抗体结合起来，标记后的抗体仍具备与相应抗原结合的免疫学活性以及酶的催化活性。酶标记抗体抗原复合物上的酶在遇到相应底物时，能催化底物分解，并使底物中的供氢体呈现颜色反应。最常用的标记酶是辣根过氧化物酶，其底物为过氧化氢，催化时需要供氢体，能产生褐色颜色反应。

（2）酶标记抗体的分类

①组化法：用于检测组织细胞中抗原、抗体及其他成分，有直接法和间接法两种。

图7.18　免疫酶组化染色法

a.直接法：与荧光抗体直接法相似。首先将待检组织进行冰冻切片或触片，干燥后用丙酮固定，用1%过氧化氢处理，以除掉组织中的过氧化物酶。滴加酶标抗体后放入湿盒中37℃作用30min，用PBS充分冲洗干净，稍晾干后置显微镜下观察，阳性者可见褐色沉淀颗粒出现与细胞内。为了便于定位，可以用苏木精-伊红复染组织片，如图7.18所示。

b.间接法：其原理、方法与荧光抗体相同，但标记酶第二抗体和加底物显色的方法同直接法。本法与免疫荧光相比，不需荧光显微镜，形态结构清楚，定位准确，并且标本片也可以长期保留。

②测定法：用于抗原或抗体的定量测定。

常用的是酶联免疫吸附试验法（ELISA），即将抗原或抗体吸附在聚苯乙烯塑料反应板的载体上进行免疫酶染色，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。该方法能够测定极微量的抗原抗体，操作也十分简便，因此是目前应用非常广泛的一门技术，主要包括有间接法、夹心法以及抗原竞争法等。