抗原抗体反应的试验方法很多，不论哪种方法基本原理都是抗原与相应抗体的特异性结合。主要常用的方法、反应形式有凝集反应和沉淀反应。

1）凝集反应

颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）与相应抗体相遇后，在电解质参与下出现肉眼可见凝集物的现象，称为凝集反应。反应中的抗原为凝集原，抗体为凝集素。

凝集反应可在试管、玻片及微量滴定板上进行，分别称为试管凝集反应、玻片凝集反应和微量凝集反应。测定血清中抗体含量时，将血清连续稀释（2倍、5倍或10倍连续稀释）后，加入定量的抗原；而测定抗原时，则将抗原连续稀释后，加定量的抗体。试验以出现明显反应终点的抗血清或抗原制剂的最高稀释度为该血清或抗原的效价或滴度。由于稀释跨度很大以及作为标准物的抗原或抗体一般没有绝对含量，因此这种测定只是半定量的和相对的。

常用的凝集反应有直接凝集反应、间接凝集反应、协同凝集试验和抗球蛋白试验等。

（1）直接凝集反应

直接凝集反应（Direct Agglutination）简称凝集反应。此反应是颗粒性抗原的表面结构成分，例如细菌和红细胞的表面抗原，与相应抗体结合后发生凝集的反应。参与反应的主要因素很少，只有抗原和相应的抗体，所以该反应敏感、特异，便于操作。如：检验布氏杆菌的瑞特氏反应、沙门氏菌的凝集反应以及血型试验均为直接凝集反应。

①玻片法：将已知抗血清1～2滴滴于洁净玻片上，取待检菌液加入其中并混合均匀，数分钟后若有可见的凝集现象即为阳性反应。此法简单迅速，常用于细菌鉴定或畜禽传染病的诊断，如布氏杆菌病及鸡白痢等。

②试管法：试管法是一种定性与定量的方法，通常用已知抗原检测待检血清中是否存在相应抗体和检测该抗体的含量，应用于临床诊断或流行病学调查。试验时，用一列试管将待检血清用0.5%石炭酸生理盐水10倍递进稀释，每管0.5 mL，一管不加血清作对照。每管中加入一定浓度抗原0.5 mL混合均匀，在37℃或室温静置数小时，观察液体的亮度及沉淀物，视不同凝集程度记录结果：++++（100%凝集）、+++（75%凝集）、++（50%凝集）、+（25%凝集）和-（不凝集）。凡能与一定量抗原发生50%凝集（++）的血清最高稀释度成为凝集价或效价（滴度）。此法常用于布氏杆菌病的诊断和检疫。

（2）间接凝集试验

可溶性抗原与相应抗体不能发生可见的凝集反应，如将其吸附在与免疫无关的颗粒型载体表面后再与相应抗体结合，在有电解质存在的适宜条件下，即可出现肉眼可见的反应，此种试验被称为间接凝集试验。常用的载体有动物红细胞、聚苯稀乳胶及活性炭等。将可溶性抗原吸附到载体颗粒表面的过程称为致敏。

将抗原吸附于载体颗粒，然后与相应的抗体反应产生的凝集现象，称为正向间接凝集反应，又称正向被动间接凝集反应。将特异性抗体吸附于载体颗粒表面，再与相应的可溶性抗原结合产生的凝集现象，称为反向间接凝集反应。

①间接血凝试验：动物的红细胞均匀一致，表面能吸附多种抗原。间接血凝试验便是以红细胞作为载体吸附抗原的凝集试验。为了避免血清异嗜凝集，可采用同源红细胞。将可溶性抗原致敏于红细胞表面，用以检测未知抗体，再与相应抗体反应出现肉眼可见的凝集现象，称为正向间接血凝试验。如将已知抗体吸附于红细胞表面，用以检测样本中相应抗原，称为反向间接血凝试验。致敏红细胞几乎能吸附任何抗原，而红细胞是否凝集又容易观察。因此，利用红细胞作载体进行的间接血凝试验广泛用于多种疫病的诊断和检疫，如病毒性传染病，支原体病、寄生虫病的诊断与检疫等。

②乳胶凝集试验：乳胶又称胶乳，是聚苯乙烯聚合的高分子乳状液，对蛋白质、核酸等大分子物质具有良好的吸附性能，用它作为载体吸附抗原（或抗体）用以检测相应的抗体（或抗原）。本法具有快速简洁、保存方便、比较准确等优点。

③协同凝集试验：该试验中的载体是一种金黄色葡萄球菌，此菌的细胞壁上含有葡萄球菌A蛋白（SPA），SPA能与人和大多数哺乳动物血清中的IgG分子的Fc片段发生结合，并将IgG分子的Fab片段暴露于葡萄球菌的表面，保持其活性。当结合于葡萄球菌表面的抗体与相应抗原结合时，形成肉眼可见的小凝集块，该法称为协同凝集试验。此法已广泛应用于多种细菌病和某些病毒病的快速诊断。

2）沉淀试验

可溶性抗原与相应抗体结合后，在适量电解质存在的情况下，能形成肉眼可见的白色絮状或颗粒状沉淀的反应，称为沉淀试验。参与反应的抗原称为沉淀原，如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒、异体血清和组织渗出液等。沉淀原为多分子状态物质，单位体积中含量高，故做定量试验时常稀释抗原；相应的抗体称为沉淀素。

沉淀试验可分为在液体中进行的沉淀试验（环状沉淀与絮状沉淀）和在琼脂凝胶中进行的琼脂扩散试验。后者又可与电泳技术结合，发展为免疫电泳、对流电泳以及火箭电泳等技术，这些技术已在血清学试验中广泛应用。

（1）环状沉淀试验

在小试管中加入已知抗血清至管底，然后小心从壁缘将稀释的抗原叠加其上，强反应可在1～2min内出现白色环状沉淀；若反应出现较迟，一般1 h判定，3～5 h再观察一次后综合判定。测定抗血清效价时可先将抗原做系列稀释，用毛细滴管将抗血清加入多个小试管底部，再将不同稀释度的抗原分别小心叠加其上，出现沉淀环的抗原最大稀释倍数即血清的沉淀价。本法可用于炭疽病诊断、链球菌定型以及抗血清效价测定等。

（2）絮状沉淀试验

抗原抗体在试管内混合，比例最合适者出现絮状沉淀最快，沉淀物最多。相反，抗原或抗体过剩均会抑制沉淀的出现。例如，用4～5列试管，先将抗原从1∶10开始对倍稀释，每管0.5 mL；抗血清1∶（5～40）4个稀释度，每管0.5 mL。振荡混匀后放置室温，在黑暗背景下观察记录较早出现反应的试管，数小时后比较各管浑浊度。以反应出现最早且浑浊度最大的试管定位抗原抗体的最适比。(www.daowen.com)

（3）琼脂扩散试验

琼脂凝胶呈网状结构，网格直径与琼脂浓度呈反比，内部充满水分。1%琼脂网格直径约为80 nm，能允许大多数抗原抗体分子在琼脂凝胶中自由扩散。抗原抗体在凝胶中相遇并于比例最适处形成复合物。该复合物较大，不能继续扩散而形成沉淀带，此种反应称为琼脂扩散试验。通常有如下4种类型。

①单向单扩散：也称简单扩散。在内径3 mm、长10 cm的小试管中进行。先将0.6%～1.0%琼脂加热融化，待冷至56℃的抗血清（1∶10稀释），混合后加0.5 mL于上述小试管内；凝固后加0.5 mL抗原于其上，37℃垂直放置，沉淀线最早2～3 h出现。由于抗原在柱内继续扩散，最适比位置不断向前推移，原先的沉淀线因抗原浓度过大而溶解，故沉淀带的位置亦随抗原扩散而推移，最后达到稳定。抗原浓度愈大则沉淀带的距离也愈大，因此可用于抗原定量［图7.13（a）］。

图7.13　单向单扩散和单向双扩散

（a）单向单扩散；（b）单向双扩散a、b抗原；A、B相应抗体

②单向双扩散：与上法基本相识，在小试管内进行。但在抗原和抗体之间加一层不含抗体的盐水（或PBS）琼脂，抗原抗体在此中间层扩散并在最适比处形成沉淀带，常用于复杂抗原的分析，如图7.13（b）所示。

③双向单扩散：亦称辐射扩散或环状扩散，在平皿或玻板上进行。将2%琼脂缓冲盐水融化后冷至45℃，加等量预热至等温并经适当稀释的抗血清，混合后趁热倒入平皿或玻板上，厚1～2 mm，凝固后在凝胶板上打孔，孔径2～3 mm，孔距8～12 mm，于孔内滴加抗原2～3μL后密闭扩散48 h。抗原在抗血清琼脂中扩散并形成白色沉淀环，环的大小与抗原浓度呈正比，可用于抗原定量或诊断传染病。

例如，鸡马立克氏病的诊断，可将抗马立克氏病血清倾成血清琼脂凝胶板，拔取病鸡腹部羽毛数根，自毛根尖端1 cm处剪下，插入此血清琼脂凝胶板上，阳性者毛囊中病毒抗原向四周扩散并形成白色沉淀环。

④双向双扩散：简称双扩散。将1%琼脂磷酸缓冲液盐水倒成平板，厚3 mm。在其上按设计的图形打孔，孔内分别加入抗原和抗体，置密闭盒内，防止水分蒸发。在37℃或室温放置数日，观察沉淀带。每一成分出现一条沉淀带，两相邻孔之间若抗原相同，则两条沉淀带相互融合；抗原不同则相互交叉；部分相同则形成分支，如图7.14所示。

本法操作简单，应用广泛。现已普遍用于细菌、病毒的鉴定及传染病的诊断。如鸡马立克氏病、牛白血病和马传染性贫血等的琼脂扩散试验已成为流行病学调查和检疫的重要手段。

图7.14　双向双扩散的4种基本类型

a、b单一抗原；ab同一分子上两个决定基a′表示含量少；A、B相应抗体

（4）免疫电泳

免疫电泳是在琼脂扩散基础上再结合电泳技术，将二者的优点结合起来，可极大地提高免疫扩散的分辨力和敏感性。在临床上应用比较广泛的有对流免疫电泳和火箭电泳。

①对流免疫电泳：在pH8.6的琼脂凝胶中，免疫球蛋白带有微弱的负电荷，不能抵抗电渗作用，故在电泳时反而向负极迁移；而一般抗原蛋白带有较强的负电荷，抵抗电渗后仍向正极迁移。如将抗原置于阴极，抗体置于阳极，电泳时二者相向移动，在相遇处形成沉淀带。由于抗原、抗体在电场下定向移动，提高了反应的灵敏度，因而缩短了沉淀带出现的时间。本法一般比琼脂双扩散敏感10～16倍。

实验时，在凝胶板上打孔，两孔为一组，并排打孔两组后加样。抗原滴入阴极端孔内，抗体滴入阳极端孔内进行电泳。一般泳动30～90 min后观察结果，在两孔之间出现沉淀带的为阳性反应，如图7.15所示。

图7.15　对流电泳图形

②火箭电泳：将双向单扩散与电泳技术结合起来，其沉淀线似火箭，故名火箭电泳。先配制含有抗血清的琼脂凝胶板，抗血清含量需事先测定。在玻板一端打一列小孔，孔径3 mm，孔距8 mm，将待检抗原滴加小孔内，以每厘米宽度用2.5 mA电流电泳2～10 h。电泳时抗原在含抗血清的凝胶板中迁移，二者在比例最适当处形成火箭状沉淀带。在电场作用下抗原继续向前推移，原来的沉淀带被过量的抗原所溶解，新的沉淀带也随着向前移动，直至最后形成稳定的火箭沉淀带。火箭的高度与抗原浓度呈正比，因此可用于抗原定量。