由于新教各宗派如路德宗、加尔文派以及慈温利派等各主要派别在欧洲大陆本土已经存在着尖锐的分歧，所以他们较少在欧洲以外再寻求拓展自己宗派势力的可能性。同时，荷属东印度公司和西印度公司的领导人也不太可能将宗教信仰的传播作为公司发展的主要目标。不过，东印度以及西印度公司的领导层很快发现有两个与宗教信仰有关的亟须解决的问题。第一，公司需要为自己的雇员解决信仰上的需要，包括在漫长的海上航行中为士兵以及海员提供宗教信仰上的服务；同时，为了维持殖民地的秩序，也需要新教的神职人员维持公司雇员们在当地的宗教生活，这对于维持殖民地的社会平稳和道德、纪律是必不可少的。第二，公司还要应付罗马天主教会在世界各地的殖民地已经建立的教会体系所带来的挑战，他们更要应对殖民地原先就已经根深蒂固的印度教以及佛教等本土宗教的存在。在这两个层面上，公司有赖于新教牧师在这些区域推广其宗教信仰，这毕竟对于公司业务的展开是有利无弊的。

尽管荷兰东印度公司以及西印度公司的特许状中对于加尔文派牧师的活动范围并无明文规定，也没有规定这些牧师们有任何的义务去推广加尔文派改革宗教义，但是这两个公司的领导人很快就明白他们有义务和责任去支持加尔文派牧师的传教事业。在荷属东印度公司两个世纪的扩张事业中，公司的领导人以公司本身的资金资助了大约1000名加尔文派的牧师以及数以千计的平信徒传教员和学校校长前往殖民地的传教区从事传教以及文化教育事业。“17绅士”还提供资金建造以及维持教堂和学校，还在亚洲设立了几所神学院(尽管它们的寿命都不长)。他们还提供资金印刷《圣经》以及其他基督教文学作品，这些宗教书籍都以荷兰文以及亚洲各地的方言印行，其发行的数量和范围也都不算太小。虽然荷兰东印度公司领导人在宗教热忱方面不能与罗马天主教会的人士相提并论，但与同时期的英国东印度公司的领导人相比，他们则远远超过了后者。

尽管“17绅士”大多有各自的加尔文派的宗教信仰的背景，在国内也受到加尔文教会的压力，要他们支持加尔文教会在海外传播“真正的改革宗基督教信仰”，但是他们仍然坚持在海外的教会人士要服从公司的领导。他们坚持，去海外的传教士待在什么地方以及待多久都要听从巴达维亚总督以及各殖民地长官的指示，而不是服从教会评议会的命令。东印度公司阿姆斯特丹总部命令巴达维亚的总督以及评议会要阅读和检查所有的传教士以及东方的教会评议会寄给尼德兰加尔文教会当局的信件。“17绅士”也要求东印度公司的平信徒官员要列席教会评议会的会议，参与这些机构所做的决定并敦促他们与公司官员合作。当时，传教士以及由平信徒充当的传教员的工资都是由公司而非教会支付的，在公司的主管领导层看来，传教士与拿薪水的职员是一样的，传教士应当首先执行公司领导层的决议。最后，尽管“17绅士”承认传教事业必须有合格的传教士支撑，他们还是关闭了1622年成立于莱顿的传教士训练学校(印度神学院，Seminariaum Indicum)，该学院成立以及运作的时间只有10年之久。他们也拒绝了尼德兰宗教会议关于重新开设这所神学院以及设立新的神学院的建议，理由是经费短缺以及没有足够的传教士响应圣召。但是真正的原因很可能是因为“17绅士”担心一旦神学院建立，传教士们将会服从于自己的长上而非公司的董事。在此情况之下东印度公司很难找到合适的传教士前往东方从事传教事业，也很难保证他们在艰苦的条件之下长久地坚持工作。在西印度公司管辖范围内的传教士也是处于同样的情况。

尽管如此，荷兰人在海外的传教事业还是有一些进展的。在荷兰殖民者侵占中国台湾地区期间，有一些加尔文派的牧师曾经进入当地进行传教。派驻台湾的荷兰加尔文派牧师是由巴达维亚宗教事务院派来的，从东印度公司领取薪金。按照教会的规定，牧师接受按手礼以后就可以就职，有权分发圣餐以及施行洗礼，并从事传教活动。为了辅助牧师的传教活动，另外派有教师、候补牧师以及传教员等人，这些人没有接受按手礼，无权执行圣事典礼。所有的牧师都要根据自己的能力负担一些世俗的事务。在殖民地进行传教活动，最基本的任务就是要学习当地的语言。这些牧师初到当地以后，所做的仅仅是在热兰遮城或者是赤坎城为荷兰的官员以及士兵主持礼拜，等于是“军中牧师”。在学习当地的语言有所进步以后，就被分派到各地从事传教，成为名副其实的传教士。每一名牧师不能只在当地传教，需要到各地巡查，从北方一直到淡水以及基隆等地，南部的传教区更加广大，身体不健康的传教士往往不太愿意去南部地区。为了让当地的居民了解基督教的教义，他们有时还要充当学校教师的角色。由于传教士的薪俸是公司支付的，公司也就要利用传教士安抚当地的居民，因为他们熟悉当地的语言；有时，公司还要利用他们来传达政令、经管税收、折放银钱、办理当地居民的狩猎执照以及替公司收购鹿皮、代为召集地方的会议。有些传教士的薪金比较高，可以与公司高级职员相匹敌，但是学校教师的薪水就低得多。第一位来中国台湾地区传教的是甘治士(Georgius Canidius)，他受命于巴达维亚宗务院，于1627年5月首度来台湾，1631年离开，以后又于1633年至1637年在台湾传教。尤罗伯(Robertus Junius)，1629年至1641年以及1641年至1643年在中国台湾地区。林礼文(Joannes Lindeborn)，1636年至1637年在台湾，等等。赖永详著有《明末荷兰驻台湾传教人员之阵容》一文，(载《台湾风物》1966年6月)检视了当时荷兰人在中国台湾地区传教的情况。

当时荷兰在中国台湾地区的传教士，不仅利用罗马字拼音学习当地的语言，为了传教的需要也将罗马字推广于当地人中间。荷兰人最初接触当地的语言，就是大员(安平)、新港、麻豆一带人所讲的新港语，学者又称之为西拉雅语(Siraya or Sideia)。据说甘治士编有新港语词汇以及若干祈祷文的注释；尤罗伯又编有新港语以及放索语词汇，均已失传(荷兰乌特勒支大学图书馆藏有Vocabularium Formosanum，为新港语词汇，有学者猜想可能是甘治士或者是尤罗伯所编的词汇表)。尤罗伯所编的教义书祈祷文仍然藏于加尔文派教会阿姆斯特丹大会档案馆(Archiefder Classis Amsterdam)，而且零零散散刊行于各种书刊。尤罗伯也曾经选择了一些教义的入门书籍，在本国印行出来以后运载到中国台湾地区，分发到学校里应用。1646年，荷兰传教士范布链(Simon van Breen)以及哈约翰(Joannes Happartius)改编了这些教义书籍。1647年，另一位荷兰传教士倪但理(Daniel Gravius)又编辑了教义问答书。哈约翰还改译了主祷文、信经、十诫等。倪但理更是将荷兰本国所用的祈祷文译为当地语言，也修改了洗礼以及结婚的仪式。倪但理所编辑的新港语以及荷兰语对照的《信仰要目》于1662年印行。1939年，中国台湾地区根据莱顿大学所藏的这部书籍重新印行。倪但理也曾经翻译过《马太福音》以及《约翰福音》，均已失传。范布链还曾经编撰过台湾北部的法波兰语(Favorlang)词汇表，但已经失传。还有一位荷兰传教士范德烈(Jacobus Vertrecht)曾经编撰过《法波兰地区学校用教材》(Ten gebruikke der Schoolen vant Favorlangs’ district)，原稿藏于巴达维亚学会，于1888年以及1896年被重新刊行。荷兰传教士的这些文化工作留下了一定的影响。1715年，当耶稣会士德·麦拉(De Mailla)到访中国台湾地区的时候，他发现当地的一些原住民仍然能够阅读荷兰文的书籍以及使用罗马化的词汇。这些词汇甚至直到19世纪下半叶还在被人们使用。

1605年，当荷兰人取代葡萄牙人占领安汶岛的时候，他们发现耶稣会士已经在本岛以及临近的岛屿皈化了1.6万名原住民，尽管岛上大部分居民都是穆斯林，或者是信仰万物有灵的人。荷兰人在占领了该岛屿以后，一直防止天主教的传教士以公开或秘密的方式再回到这里。由于群龙无首，这些当地的罗马天主教徒逐渐地从信仰天主教改为信仰新教，不过这一过程十分缓慢，效果也不是很好。新教传教士在知识方面以及传教热忱方面似乎也略逊于天主教的传教士。在荷兰人取代葡萄牙人占领安汶岛以后的150年，有一名新教人士观察当地基督徒的信仰情况以后指出，当地的加尔文派牧师“普遍地冷漠以及缺乏热忱”，在归化安汶岛的岛民方面成效不彰。不过，博克塞认为这样的批评可能有点夸张，因为事实上荷属东印度公司统治安汶岛期间，加尔文派教徒的势力有了长足的发展，这个过程在19世纪的时候更加明显，以至于他们与该岛的穆斯林之间的裂痕加大了，发生了一些冲突。当20世纪印度尼西亚独立的时候，有几千名安汶岛的基督徒岛民甚至寻求到尼德兰避难。

照理说在荷兰征服锡兰以后，那里的新教徒的人数应该有很大的增加，但是事实并非如此。1658年，荷兰人最终将葡萄牙人驱逐出锡兰，他们发现岛上有25万名原住民罗马天主教徒，大多数人都在贾夫纳的泰米尔王国，只有一小部分的“吃教者”皈依了加尔文派，大部分人都在葡萄牙天主教神父被驱逐出境以后仍然持守原有的天主教信仰。1687年以后，来自果阿的印度本地籍祈祷会神父约瑟夫·瓦兹(Joseph Vaz)及其后继者来到锡兰以后，这些原有的本地籍的罗马天主教徒变得更为坚定，人数也有所增加。相比之下，荷兰新教传教士的人数比较少，博克塞指出在任何一段固定的时间里都没有超过20名加尔文派的牧师待在锡兰。在此期间，也有少数的传教士学习过当地的语言和文化，如菲律普斯·巴达乌思(Rev. Philippus Baldaeus)牧师学习了泰米尔语，约翰内斯·吕尔(Rev. Johannes Ruel)牧师学习了僧伽罗语。但是这种间断的和偶然的努力都没有在根基深厚的佛教以及印度教的信徒中产生过深刻的影响。公司的官员固然也愿意看到加尔文派的牧师去归化那些天主教徒(他们视这些天主教徒为葡萄牙人的“第五纵队”)，但是他们不太愿意去打扰那些佛教徒以及印度教徒的礼拜仪式以及社会活动，他们害怕这些人数众多的本地信徒会攻击荷兰人的教会。为了在锡兰维持长期的传教活动，荷兰人在锡兰建立了两座神学院以培养本地的神职人员。第一所是建于1690年至1723年之间的位于贾夫纳帕塔姆(Jaffnapatam)附近的那努尔(Nallur)的神学院，这一地区的人民讲泰米尔语；第二所神学院则位于科伦坡，维持的时间要长达近一个世纪(从1696年至1796年)，当中有过中断，这一地区的人民则讲僧伽罗语。这两所神学院专门培养本地的学校校长、传教员、译员以及为政府官员服务的神职人员。这两所神学院教授荷兰文、拉丁文、希腊文甚至希伯来文。在古斯塔夫(Baron Gustaaf van Imhoff)于1736年至1740年担任锡兰总督期间，他特别支持这两所神学院的教学活动。他后来还资助建立了巴达维亚神学院，不过它存在的时间很短(1745—1755年)。在这些神学院中毕业的神学生许多人后来成为加尔文教会的牧师，其中有少数人后来去了荷兰通过进一步的深造拿到神学博士学位。其中，锡兰的两所神学院中培养的人才比较多，主要是传教员、乡村学校的校长以及在政府中服务的神职人员；很少有人成为加尔文教会以及当地的荷兰人团体的牧师，也很少有人去那些不信基督教的人民中从事归化的工作。皈依加尔文教派的僧伽罗人以及泰米尔人都是在荷属东印度公司中服务的本地人，他们的信仰根基不深。当后来英国人征服了由荷兰人统治达一个半世纪的锡兰地区以后，许多当地人都迅速而彻底地放弃了加尔文派的信仰。

荷属西印度公司统治下的从非洲西海岸至美洲大陆上的荷兰新教传教事务与东印度的情况大同小异。在新荷兰以及从1630年至1654年荷兰人统治下的巴西地区，加尔文派的牧师不仅要与信仰罗马天主教的葡萄牙人定居者以及天主教会的传教士展开竞争，还要与从欧洲移民过来的人数相当多的犹太人竞争。在累西腓，就像在巴达维亚一样，公司的高层官员对于制定反对罗马天主教徒以及犹太人的法律不感兴趣。在巴西，如上所述，在莫里斯伯爵统治期间，当局执行开明的宗教政策，对于加尔文教会牧师在地区宗教会议上屡次提出的反对罗马天主教徒以及犹太人的动议采取了冷淡以及搁置的态度。无论在南美洲或是亚洲，由于各地的荷兰行政官员以及东西印度公司上层的这种态度，加尔文派的牧师都无法与其宗教教派上的对手竞争。在巴西，还有一些荷兰定居者与当地的葡萄牙妇女结婚，婚后都皈依了妻子所信奉的罗马天主教。在1641年至1648年荷兰人短期占领罗安达以及本格拉期间，也发生过类似的情况。(www.daowen.com)

荷兰加尔文教会的牧师倒是在未开化的美洲印第安人如图皮族以及食人的塔普亚族中间发展了一批自己的信徒。在这些原始部落中没有人与加尔文派牧师竞争，一些蛮族的青年被送往尼德兰接受教育。1614年，在恩克赫伊曾印行了一部图皮语的加尔文教理问答，加尔文教会想把这部书籍在巴西的印第安人中分发，不过并没有抄本留下来。曾经有传教士想把《圣经》翻译成图皮语，但是这个计划并没有付诸实施。有几位在荷兰接受教育的塔普亚族青年在回到自己的部落以后仍然回到了他们原有熟悉的原始状态，尽管他们对自己在欧洲的经历以及所学的东西保留着强烈的记忆。在荷兰人被驱逐出巴西以后，有一名葡萄牙耶稣会士来到了内陆的印第安人村庄，他们惊讶地发现“许多印第安居民是加尔文派以及路德派的教徒，就像生活在英格兰和德意志的新教徒一样”。著名的葡萄牙耶稣会士安东尼·维埃拉以及他的同伴们忙着要清除这些新教的“异教思想”残余影响的痕迹。

1624年至1664年荷兰的加尔文派教会在北美的新尼德兰也有所发展，呈现出与东印度以及西印度相似的一些特征。由于这里地广人稀，路途遥远，很难招募到加尔文派的牧师到当地服务。西印度公司的领导层“19绅士”要求在北美的加尔文派教会严格地服从民事当局的管辖。在新尼德兰地区，较少有罗马天主教会的传教士的活动，只有在讲法语的北美加拿大地区偶尔有耶稣会士出现在那里从事传教事业。加尔文教会的牧师必须花费更多的时间和精力与来自英格兰的国教会以外的新教传教士展开竞争。在1654年以后，还要与犹太人竞争。当然，他们也要从事归化印第安人的工作，不过他们向印第安人传教的效果总是不太好。皮特·斯图亚维瑟特(Pieter Stuyvesant)是殖民地最后一任总督，他本人是一名虔诚的加尔文派信徒，经常附和与支持加尔文教会的牧师，过度地压制其他新教教派的活动。但是公司的其他领导人则对此持不同的意见。1663年4月，他们向总督指出对于新教其他派别不应当采取如此严厉的态度，这样做对于殖民地的发展是不利的，会使得外来的移民减少并使得已经居住在当地的居民外流。他们认为殖民地当局应当容忍非加尔文派的信徒以自己的方式敬拜上帝，这样做并不会打扰加尔文教会的宗教活动。西印度公司的“19绅士”再三提醒各地的总督：在宗教信仰上持宽容的态度将有利于荷兰以及阿姆斯特丹的繁荣与发展，同样对于新尼德兰也是有益无害的。东印度公司的“17绅士”们以及历届阿姆斯特丹的市长们在许多场合都这样不断地申明他们的立场。

在西印度公司管辖下的非洲西海岸的一些地方，在17世纪早期的一些时候，有一些加尔文派的牧师被派到荷兰人占据的黄金海岸要塞以及商站等地去从事传教活动。他们既要照管从事黑奴和象牙贸易的荷兰商人的牧灵需要，又要归化所谓的“异教徒”——黑人。他们的努力没有取得太大的成果，只要可能，他们中的许多人就尽快地回到自己的祖国，因为他们难以忍受当地恶劣的生活条件以及炎热难当的气候。1645年以后，就没有加尔文教会的牧师志愿来到非洲西海岸服务了。荷兰改革宗教派，偶尔派一到两名平信徒的诵经员来到荷兰人占据的三个主要的要塞即埃尔米纳、拿骚以及阿克辛姆城堡。他们在早上以及傍晚规定的时间里引领大家祈祷，每星期为当地的荷兰人诵读《圣经》经文以及布道两次。他们并不从事其他的传教活动。在非洲只有一个非常特别的例外：有一位完全是黑人血统的加尔文派牧师，他的名字叫雅各布斯(Jacobus Eliza Joannes Capitein)，他的出身是一名黑人奴隶，1728年他11岁的时候被人带到荷兰，然后他自然地就成为一名自由人。他的前主人和一些有影响的朋友支助他的教育费用，让他在莱顿大学接受神学教育。1742年，他从莱顿大学毕业，以拉丁文写了一篇论文，论述从《圣经》看奴隶制度的合法性，这篇论文以拉丁文以及荷兰文印行了好几个版本，被奴隶制度以及奴隶贸易的辩护者广为引用。同年，他在被阿姆斯特丹教会当局安立为牧师以后被西印度公司的领导层送回米纳要塞。开始时，他能够与荷兰人与当地人保持良好的关系，但是后来就遇到了困难。雅各布斯写报告指出很少有欧洲人参加教理问答班，大部分的欧洲人都是罗马天主教徒和路德宗信徒，荷兰的加尔文派信徒只对日常的生意感兴趣。他的这番描述有助于解释荷兰加尔文派教会在别的热带地区为什么同样面临失败。他为黑人以及混血儿开办了一所学校，将祈祷经文以及“十诫”翻译成当地的语言文字。一些当地的欧洲人对他有种族偏见，不过荷兰在当地的总督支持他，他还与一位来自乌特勒支的荷兰姑娘结婚成家。但是后来又陷于与一位没有受洗的非洲女孩的丑闻当中。由于他在归化黑人以及白人的传教工作上长期没有收获，最后他放弃了传教士的工作去经商。不过他的经商事业也不成功，最后死于1747年1月。

博克塞曾经将欧洲以外地区的荷兰人的新教传教事业与伊比利亚人的天主教传教事业做过比较，他认为天主教的传教事业在下列几个方面超过了新教：第一，天主教早于新教在非洲、美洲以及亚洲的许多海外地区建立了稳固的教会，已经在信众中奠定了比较深厚的基础。第二，天主教会的礼仪多姿多彩、教堂建筑和雕刻绘画华丽动人，远比新教严肃单调的布道以及墙壁刷得雪白、内部空空如也的教堂能够吸引更多的亚洲民众。从外表的宗教礼敬来看，天主教与亚洲传统的宗教如印度教和佛教也有某种相似之处，如使用圣像、念珠以及崇拜圣徒等，所以当亚洲各地的人们初次接触天主教的时候，他们对于天主教的敬拜方式并不陌生。这三种不同的宗教对于神秘事物的理解以及敬拜的方式有着共通的地方，相比之下，加尔文派的牧师不能够也不愿意向信徒传授这样的宗教礼仪。荷兰加尔文派的牧师只能够在罗马天主教会传教士发展的原有的天主教信徒中从事归化工作，他们没有大量地在印度教、佛教信徒中从事归化工作，也没有能力以及知识这样做。第三，天主教会的传教士人数众多，又来自不同的国家，可谓源源不断，可是在亚洲的荷兰的新教牧师却是寥寥无几。1647年，从锡兰、科罗曼德尔至摩鹿加群岛的广大群岛只有28名荷兰加尔文派的牧师；在巴达维亚，1670年有2万人口，1678年有1.6万人口，1669年的时候只有6名加尔文派牧师，1680年有8名，1725年有27名(其中还有一部分在别的港口等待)，1749年只有12名牧师，到了18世纪末叶的时候，那里只有2名加尔文教派的牧师了。这个数字与葡萄牙、西班牙、法国、意大利等国籍的天主教在亚洲的传教士人数相比就几乎没有什么意义了。18世纪的时候，在锡兰的天主教会传教士的人数则更多，尽管当时在锡兰的荷兰人的殖民地里有天主教会传教士的活动是属于非法的。更有甚者，荷兰加尔文教会的牧师是结婚的，因此他们经常在不同的工作岗位上调动，而罗马天主教会的教士是独身的，他们在许多年当中总是待在一个地方，有时会一辈子待在一个地方传教终身。葡萄牙耶稣会士在亚洲的高级教士安东尼奥·卡丁(Antonió Cardim)于1652年在马六甲被俘虏，他质问当地的荷兰加尔文教会的牧师，为什么荷兰人能够容忍其他宗教的庙宇，但是却不能容忍天主教会的活动。那位牧师很坦率地回答，如果允许天主教会的活动，他的“羊群”就会跑到天主教会里面去了。

在整个荷兰东印度公司在亚洲活跃的时期，荷兰加尔文教会的牧师一直难以与天主教的传教士竞争，笼络住自己的“羊群”。在巴达维亚、马六甲、科罗曼德尔、锡兰以及马拉巴的欧亚混血儿社团中，人们只要有机会，就会冒险脱离加尔文教会，去往天主教会参加弥撒。博克塞指出葡萄牙人与荷兰人相比，即便在一些他们的政治权力运用不受约束的地方常常采取一种强制性的而不是劝导性的方法推广他们的宗教信仰，他们也能够让罗马天主教在许多地方扎下深厚的根基。荷兰东印度公司的总督迪曼并不是一个非常热忱的加尔文派教义的信徒，但是他在1631年写信给“17绅士”的时候指出，在宗教传播领域伊比利亚的传教士“太强过我们了，他们笃信教宗制度的神父，表现出远超过我们的布道家和读经信徒的热忱和精力”。他当时说的是中国台湾地区的传教情形，那还是荷兰加尔文派教会在远东传教事业上比较活跃的地方。还有一位荷兰人在17世纪末年写道，葡萄牙人之所以能够在小巽他群岛等地保持住他们风雨飘摇的地位主要就是由于“大多数的本地人站在葡萄牙神职人员的一边，因此远远地优胜于我们，由此他们能够收获到完全的益处。在锡兰和南印度，人们在天主教信仰的激励之下有力地抵抗荷兰人的统治。一名苏格兰加尔文派教徒亚历山大·汉密尔顿(Alexander Hamilton)抱怨说在赞比西亚以及莫桑比克沿海地区的当地人除了葡萄牙人以外，他们不愿意与任何人贸易，在沿海住着一些葡萄牙神父，他们恐吓那些愚笨的原住民，并从他们那里得到象牙和黄金。在北京宫廷里的耶稣会士也极力阻挠与挫败荷兰人试图与中国建立官方性质的贸易的努力，尽管全体广东与福建的地方官吏在1644年清军入关以后支持与荷兰‘红毛夷’通商”。博克塞指出：“在整个17和18世纪，加尔文主义在热带地区的居民中很少甚至没有留下很深的印象。与任何活跃的宗教信仰，如印度尼西亚群岛的伊斯兰教、印度的印度教、锡兰的佛教或是由葡萄牙人在一些地方播下的罗马天主教相比，加尔文主义如果没有国家的力量作为后盾予以支持，就不会产生持久的影响。”

但是，事物的发展往往展现出另外一个方面。天主教传教事业的成功并不总是给葡萄牙人带来有利的形势，反而给荷兰人在东方的贸易渗透造成新的机会。正是由于担心日本的天主教徒成为国内的“第五纵队”，1639年德川幕府关闭了与葡萄牙人长达近一个世纪的通商关系，闭关锁国。相反，正是因为荷兰人在传教方面表现出的冷淡，日本人才愿意与之贸易，并且长期以来一直维持了与荷兰人的特殊关系。在17世纪的早期，英国人与荷兰人一再告诉日本人，葡萄牙人将利用天主教的传播来扩大自己的势力与影响，挑动九州地方信奉天主教的大名反对幕府中央政权，激发了日本幕府官员内在的恐惧与担忧。虽然幕府和长崎奉行越来越倾向将葡萄牙人一劳永逸地驱逐出日本，但是他们又贪图与葡萄牙人通商带来的商业利润，他们看到运来的大宗的丝绸的价值高于荷兰人和中国人带来的，也高于一些仍然被允许去印度支那的“朱印船”带来的，所以幕府迟迟没有跨出最后的一步。在1635年的时候，长崎的奉行派出一些间谍和探子到长崎的葡萄牙商人团体中去打探葡萄牙人的真实的想法。这些探子与长崎主要的一些葡萄牙商人私下谈话以后得知：长崎的地方当局想让这些商人剃去头发和胡子，并穿上日本人的衣服，这些举动使得葡萄牙人感到非常惊讶、困惑和沮丧，但是最后他们回答说，为了维持与日本的贸易，他们可以屈从；不过，当这些探子进一步问到如果将来日本人要求他们在天主教信仰和与日本人贸易之间作出选择时他们将如何处置。这些葡萄牙人则异口同声地回答，他们宁愿放弃的是贸易而不是宗教信仰。葡萄牙人在天主教信仰上的坚定或者说固执使得幕府更感到担心。羽田正教授指出，对于天主教传播与扩张的担忧并非日本一个国家，东亚的大部分国家都是这样。他指出日本的当权者认为天主教是危险的宗教，有几大原因：“比如，世俗权力优于宗教权力的‘王法为本’的基本态度；天主教的教义与当时‘神国’思想建立的日本社会秩序完全不相容的问题；高达人口3%的日本天主教徒，做出狂热的反社会的举动；在荷兰人与英国人的提醒之下为政者得知天主教的传教与葡萄牙及西班牙的领土扩张野心之间的关联性，等等。此外，也有研究指出，天主教徒以外的一般民众，大多可以信奉可以称为‘日本宗’的共同宗教信仰，天主教信仰与他们所重视的‘天道’不相容，因此一般人多数都支持为政者的禁教方针。在种种因素之下，统一政权最后走向驱逐传教士、禁止天主教之路。不过有趣的是，禁止天主教的不只是日本的政权。尽管禁教的因素各有不同，继明帝国以后的清帝国、朝鲜甚至越南也都采取了同样的政策。禁止天主教是17和18世纪东亚海域周边各国的共通行动。因为支撑这个地区政权的理念与社会秩序，与天主教的教义以及把传教当成前提的世界观之间，存在着无法相容的深刻差异。因此对于东亚海域的政权而言，天主教教士的存在，意味着重大的威胁。”羽田正还指出，相比之下，耶稣会以及其他天主教修会也在印度洋海域上的岛屿以及周边国家和地区从事传教活动，在莫卧尔帝国以及法萨维帝国境内的天主教传教士的人数，超过了在东亚海域的人数。他们基本上行动自由，没有受到各地政权太多的干扰与规范。在这一点上，印度洋海域与东亚海域之间有着极大的差距。同样地，在更为遥远的信奉罗马天主教的刚果国王和本地神职人员，一边毫不犹豫地拒绝荷兰加尔文派牧师宣传新教教义，另一方面却对于荷兰人获得胜利的消息和报道欢欣鼓舞。在1641年至1648年，他们甚至在教堂里为信奉新教的荷兰军队在安哥拉击败信奉天主教的葡萄牙人举行宗教感恩圣事。一位果阿的天主教本地神职人员印度人克里索波利斯(Chrysopolis)名衔主教卡斯特罗(Dom Matheus de Castro)，出于对信奉同一宗教的葡萄牙人的极端憎恨，在1644年至1654年的十年间，一直煽动信奉加尔文派的荷兰东印度公司以及穆斯林比贾普苏丹派兵进攻果阿。

正是在来自荷兰人的各个方面的猛烈攻击之下，葡萄牙东方帝国终于衰落了。在16世纪的时候，葡萄牙在非洲西海岸以及印度洋周边地区有50个要塞或者是筑有要塞的商站，到1666年只剩下9个：其中3个在非洲；远东只剩下了中国澳门地区；印度只保留了果阿、第乌、巴辛、达曼和曹尔。葡萄牙人不能维持他们的海洋帝国在东方沿海线上的链条，其原因之一还在于战线过于漫长。当时就有葡萄牙人说：“从好望角到日本，我们不愿意放弃任何地方，冀望将每个地方都置于我们的控制之下。我们焦虑地想抓住从索法拉到日本的巨大和漫长的战线上的任何东西。”结果是，在荷兰人不断的进攻之下，葡萄牙东方帝国的殖民地的链条终于不可避免地散架和瓦解了，只有少数几个大的滨海要塞城市得以相对孤立地保留了下来。